JAR-IF11.4丨天津中医药大学揭示香豆素抑制VAV2/Rac-1信号通路改善类风湿性关节炎

今天小编给大家带来的是2024年来自于Journal of Advanced Research(IF=11.4)的一篇题为“Columbianadin ameliorates rheumatoid arthritis by attenuating synoviocyte hyperplasia through targeted vimentin to inhibit the VAV2/Rac-1 signaling pathway”的研究性文章。该文章由天津中医药大学常艳旭教授团队完成。

摘要

类风湿性关节炎（RA）是一种自身免疫性疾病，特征为滑膜炎症。天然香豆素类化合物columbianadin（CBN）在RA中的作用和机制尚不明确。本研究探讨中间丝蛋白对RA滑膜细胞生长特性的影响及CBN的调节作用。CBN显著抑制TNF-a诱导的MH7A细胞增殖和迁移，并调节凋亡和自噬相关蛋白表达。CBN直接结合vimentin，抑制其在滑膜细胞中的表达和功能。波形蛋白沉默和过表达影响RA滑膜增生和侵袭性软骨，影响细胞侵袭和迁移。CBN通过靶向波形蛋白抑制RA滑膜细胞过度激活，延缓CIA小鼠病理过程，为理解RA滑膜增生病理机制提供新靶点和见解。

Tips

①CBN可以改善TNF-α刺激的MH7A细胞的异常生长特性

②Vimentin被确认为CBN的新靶点

③CBN通过中间丝蛋白抑制VAV2/Rac-1信号通路的激活

④CBN通过抑制中间丝蛋白介导的VAV2/Rac-1信号通路改善CIA小鼠的关节炎。

⑤沉默和过表达中间丝蛋白对MH7A细胞增殖和迁移能力的影响

⑥沉默和过表达vimentin对MH7A细胞凋亡的影响

⑦沉默和过表达vimentin对MH7A细胞中VAV2/Rac-1信号通路的影响

正文

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CBN可以改善TNF-α刺激的MH7A细胞的异常生长特性。

使用TNF-α刺激的MH7A细胞构建了RA的体外模型。研究发现，CBN抑制了细胞增殖。CBN以剂量依赖的方式释放NO。伤口愈合和Transwell实验表明，CBN减弱了TNF-α刺激的MH7A细胞的迁移和侵袭能力。进一步研究表明，CBN上调了与凋亡和自噬相关的蛋白（BAX、P53、Beclin-1）的表达，并下调了抗凋亡和抗自噬蛋白（Bcl-2、p62）的表达。这些实验现象初步表明，CBN能够有效抑制TNF-α诱导的MH7A细胞异常生长。

图1. CBN对TNF-a MH7A细胞异常生长特性的影响。(A) 增殖(n = 6)。(B) NO含量(n = 6)。(C-F) 24小时迁移和侵袭的相对程度(n = 3)。(G-L) p62、Beclin-1、BAX、Bcl-2和p53的相对表达量。

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Vimentin被确认为CBN的新靶点。

为了阐明CBN调节MH7A细胞异常生长模式的潜在机制，使用ABPP技术筛选并鉴定了CBN的分子靶点。展示了ABPP的流程图和LC-MS/MS质谱的总离子流图。凝胶成像结果显示，从CBN的探针中悬挂了五种不同的蛋白带。然后通过蛋白质光谱学鉴定这些带的肽信息。基于特定肽段数量、分子量以及与RA-FLS的生物学相关性，最终确认Vimentin为CBN的直接分子靶点。GEO数据库的测序数据显示，RA患者的滑膜组织样本中Vimentin表达明显高于正常人群。此外，分子对接也显示CBN与Vimentin具有良好的结合能力，结合能量为-8.4。

图2. 视黄醇结合蛋白（CBN）的新靶点——波形蛋白的识别。（A）活性位点探针（ABPP）流程图。（B）CBN探针角度的凝胶成像。（C）LC-MS/MS分析的总离子流图。（D）LC-MS/MS分析筛选出的前六种蛋白。（E-F）在GEO数据库中对波形蛋白的分析。（G）分子对接。

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CBN通过中间丝蛋白抑制VAV2/Rac-1信号通路的激活。

为了阐明中间丝蛋白在CBN介导异常滑膜细胞生长以及相关分子机制中的作用，检查了中间丝蛋白及其下游蛋白和mRNA水平。结果显示，CBN可以降低中间丝蛋白、细胞粘附因子Rac-1以及侵袭相关蛋白MMP2和MMP9的表达，但不影响鸟苷酸交换因子VAV2的表达。进一步研究表明，CBN可以减少VAV2的磷酸化。因此推测，CBN对滑膜细胞的作用可能抑制了由中间丝蛋白介导的VAV2/Rac-1信号通路的激活。

图3. CBN对VAV2/Rac-1信号通路的影响。(A-C) 波形蛋白和Rac-1的相对表达量(n = 4)。(D-G) p-VAV2/VAV2、MMP2和MMP9的相对表达量(n = 4)。(H-I) 波形蛋白和Rac-1 mRNA的相对表达量。

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CBN通过抑制中间丝蛋白介导的VAV2/Rac-1信号通路改善CIA小鼠的关节炎

CIA模型揭示了CBN的体内疗效和作用机制。研究发现，CBN以剂量依赖性和低毒性方式有效减轻CIA小鼠足和爪的肿胀，尤其在RA早期。结果与先前报告相符[13]。H&E染色、甲苯胺蓝染色和微CT显示，CBN改善了踝关节的病理损伤，包括软骨和骨侵蚀、软骨细胞坏死钙化和滑膜炎症。此外，CBN下调了CIA小鼠滑膜组织中中间丝蛋白和Rac-1的蛋白水平，并抑制了VAV2的磷酸化。这些结果表明，CBN可能通过抑制滑膜组织中的VAV2/Rac-1信号通路来改善病理关节损伤和炎症表型。

图4. CBN通过抑制vimentin介导的VAV2/Rac-1信号通路改善CIA小鼠关节炎。(A) 动物实验过程示意图。(B) 肿胀程度(n = 8)。(C) 体重(n = 8)。(D-E) 足掌代表性图像(n = 4)，H&E染色(n = 4)，甲苯胺蓝染色(n = 4)，微CT(n = 1)。(F-I) vimentin、Rac-1、VAV2和p-VAV2蛋白的相对表达量。

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沉默和过表达中间丝蛋白对MH7A细胞增殖和迁移能力的影响。

为研究中间丝蛋白在滑膜细胞中的作用，采用si-RNA和质粒转染技术干预其表达，并观察对细胞表型的影响。实验验证了转染效率，发现si-VIM1270序列沉默效果最佳。qRT-PCR确认了沉默和过表达vimentin的抑制效果。进一步观察沉默和过表达vimentin对MH7A细胞增殖、迁移和侵袭的影响，发现沉默vimentin能降低细胞增殖和减弱迁移、侵袭能力，而过表达无显著影响。qRT-PCR还显示沉默和过表达vimentin分别降低和提高Rac-1、MMP2和MMP9的mRNA水平。

图5. 敲低和过表达波形蛋白对MH7A细胞增殖和迁移能力的影响。(A) si-RNA敲低效率验证(n = 3)。(B) 质粒转染效率验证(n = 3)。(C) 波形蛋白mRNA相对表达量(n = 3)。(D) 6个不同时间点的细胞增殖情况(n = 6)。(E-H) 迁移和侵袭的相对程度(n = 3)。(I-K) Rac-1、MMP2和MMP9的相对表达量。

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沉默和过表达vimentin对MH7A细胞凋亡的影响。

通过检查凋亡周期和线粒体膜电位来观察vimentin沉默和过表达对MH7A细胞凋亡的影响。Annexin V/PI染色结果显示，vimentin的沉默和过表达分别增加了和减弱了细胞的相对凋亡百分比。此外，TMEM染色结果显示，vimentin的沉默和过表达分别降低了和增加了细胞的线粒体膜电位。这暗示vimentin可能参与了一些与凋亡相关的途径。

图6. 敲低和过表达波形蛋白对MH7A细胞凋亡的影响。(A-B) TMRM/DAPI染色(n = 4)。(C-D) Annexin V/PI染色的相对凋亡细胞百分比

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沉默和过表达vimentin对MH7A细胞中VAV2/Rac-1信号通路的影响。

实验表明vimentin直接调控VAV2/Rac-1信号通路，并影响RA滑膜细胞增殖。免疫荧光显示vimentin和Rac-1在细胞质中重叠，暗示相互作用。vimentin的沉默或过表达影响了vimentin和Rac-1的荧光强度和蛋白水平，以及VAV2的磷酸化，说明vimentin激活VAV2/Rac-1通路，影响细胞粘附和迁移。

图7. 在MH7A细胞中沉默和过表达波形蛋白对VAV2/Rac-1信号通路的影响。(A-C) 通过IF检测波形蛋白和Rac-1的相对表达量(n = 4)。

(D-H) p-VAV2/VAV2的相对表达量(n = 4)，波形蛋白和Rac-1的相对表达量(n = 3)。

小结

这项研究初步揭示了CBN通过靶向并抑制vimentin的激活发挥抗RA效果。此外，vimentin可能通过影响滑膜细胞的增殖、迁移、凋亡以及VAV2/Rac-1信号通路的多个方面参与RA的发病机制。总体而言，本研究为RA的发病机制和寻找新的治疗策略提供了宝贵的见解。然而，需要进一步的动物和临床研究来确认这些发现，并探索vimentin在RA发病机制中的具体生物学功能。