J. Future Foods | 分子质量和链刚性对硒化香菇多糖内吞和抗肿瘤活性的影响

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Introduction

硒作为人体不可缺少的微量元素，在各种生化反应中发挥着至关重要的作用。与多糖和无机硒单独使用相比，硒多糖具有更优越性能，如增强抗氧化、抗肿瘤、免疫调节和降血糖作用。有机硒多糖包括天然硒多糖、微生物富硒多糖和硒化多糖。天然硒多糖对产地极为依赖。为解决这一限制，研究人员将无机硒引入到微生物的培养基中，利用这些微生物的代谢过程，将无机硒吸收并富集到有机硒多糖中，但硒含量相对较低。硒化多糖是由多糖上的羟基、醛基等基团与无机硒结合而成。在各种合成方法中，硝酸-亚硒酸钠法表现出最高的硒化效率而被广泛使用。

在硒化修饰过程中，氧化剂的使用可能会导致多糖发生一定程度的降解。研究表明，在硫酸酯化过程中，多糖的链构象会发生显著的变化。多糖的分子质量（Mw）和链构象对其细胞摄取和生物活性有着重要影响。比如，高分子质量（70 kDa）的葡聚糖相比低分子质量（4 kDa）的葡聚糖可能表现出更强的内吞作用。香菇多糖（LNT）是一种典型的β-葡聚糖，在全球范围内被广泛用作临床抗肿瘤药物和膳食补充剂。富含硒的LNT可以从其子实体和菌丝体中提取，显示出显著的生物活性。一些研究致力于优化反应温度、时间和其他条件，提高硒化取代度来增强其抗氧化活性。然而，目前关于硒化过程中多糖降解对其细胞摄取和生物活性的影响的研究仍然不足。因此，本研究将采用硝酸-亚硒酸钠法来硒化LN T（Se-LNT），并 研究硒化反应过程对其分子质量和链构象的影响。本研究通过对比不同取代程度、Mw和链刚性的硒化LNT的细胞内摄取率、摄取途径以及抗肿瘤效果，旨在探究硒化程度对LNT抗肿瘤活性的影响，从而为硒化修饰研究提供依据。

Results

Se-LNT的化学结构分析

由图1可知，与LNT相比，Se-LNT光谱中的多糖常见的吸收峰出现一定程度位移。Se-LNT光谱中增加 了2 个弱吸收峰，分别位于762、610 cm−1。762 cm−1处的吸收峰归因于硒酸酯中Se=O键的不对称伸缩振动，而610 cm−1处的吸收峰归因于Se—O—C的不对称伸缩振动，表明LNT成功进行了硒化修饰。

图1 FT-IR图谱

由图2可知，因此，Se以亚硒酸基团的形式与多糖相链接。

图2 LNT和Se-LNT-3的XPS图谱

由图3可知，硒化取代发生在C6位置。

图3 LNT和Se-LNT-3的NMR图谱

Se-LNT分子质量和链构象

结果表明，随着超声时间的增加，LNT样品的Mw呈下降趋势（表1）。超声降解和沉淀分级可以有效得到具有不同分子质量的LNT组分。在水溶液中，LNT及其硒化物衍生物所得α值均大于0.7，表明它们在水溶液中呈现出半刚性结构。随着硒化程度的增加，Rh值也在减小，且所有样品的Rg/Rh值均高于2.0，这也表明Se-LNTs仍保持着半刚性结构。随着超声降解程度的增加，LNT链变得更短，导致α值略有增加，即链刚性增强。硒化后，Se-LNT的链刚性略高于具有相似分子质量的dLNT，这表明硒化基团的引入增加了主链的空间位阻，并在一定程度上增强了链刚性。

表1 LNTs和Se-LNTs的Se含量以及在25 ℃水溶液中的Mw、Mn、Mw/Mn、Rg、Rh和分子链构象参数α

LNT和Se-LNT的刚果红测试结果如图4所示。在0～0.5 mol/L NaOH范围内，多糖与刚果红形成的复合物的最大吸收波长相对于刚果红有红移现象。随着NaOH浓度的增加，复合物的λmax值降低，在0.3～0.4 mol/L NaOH范围内降低最为明显。结果表明，Se-LNT仍然保持着LNT的三螺旋结构，但比LNT更容易被NaOH破坏。说明引入的硒化取代程度较低，不会破坏LNT的三螺旋结构。

图4 在不同NaOH浓度下刚果红与LNT或Se-LNT的紫外光谱λmax

LNT及其硒化物的抗肿瘤活性

图5为不同Se-LNT和LNT对HCT116细胞增殖的影响。4 种LNT对HCT116细胞没有抑制作用。添加浓度大于100 μg/mL的Se-LNTs，48 h后，细胞存活率显著降低，并呈剂量依赖性。硒化程度中等的Se-LNT-2对肿瘤细胞显示出最佳的抑制作用。从Se-LNT-2和Se-dLNT-1样品可以看出，在分子质量相同的情况下，增加硒的取代度可以获得更好的抗肿瘤活性。当硒化程度相近时，分子质量较大的Se-LNT-1比Se-dLNT-1显示出更好的抗肿瘤效果。这些结果表明，通过优化反应试剂浓度、温度和时间来提高硒化程度，并不一定会增强抗肿瘤活性，因为这往往会导致多糖分子质量持续下降。

图5 LNTs和Se-LNTs在25～400 µg内对HCT116细胞的细胞毒性

Se-LNT的细胞摄取率及内吞途径

结果可知，对于所有Se-LNTs，摄取量随时间增加而增加，并在不同时间间隔达到平台期（图6A）。Se-LNT-2的摄取速率较快，在1 h时摄取速率最高，并在3 h时达到平台期。Se-LNT-1、Se-dLNT-1和Se-dLNT-2的摄取速率相对较慢，大约需要4 h才能达到平台期。相比之下，Se-LNT-1、Se-LNT-2和Se-dLNT-1在4 h时的摄取浓度较高（分别为18.5、16.2和16.7 μg/106细胞），而Se-LNT-3的摄取浓度为8.8 μg/106细胞。

图6 时间（A）和内吞抑制剂（B）对Se-LNTs细胞摄取的影响

在4 °C的低温处理下，细胞摄取被显著抑制，这说明不通硒化多糖都是主动摄取（图6B）。 通过使用阿米洛利、氯丙嗪和菲立马林分别抑制巨胞饮、网格蛋白介导的内吞作用（CME）和 小窝蛋白介导的内吞作用（CVME）。阿 米 洛利和氯丙嗪抑制了HCT116细胞对Se-LNT-1的摄取，导致相对摄取量分别降低至25.9%和85.2%，这表明Se-LNT-1主要通过巨胞饮途径进入HCT116细胞。与Se-LNT-1类似，Se-dLNT-1对巨胞饮的依赖性略有降低。Se-LNT-2在巨胞饮途径上表现出显著下降，主要依靠CME途径，较小程度上依赖CVME途径。

Se-LNT的抗肿瘤机制

如图7所示，LNT及其超声降解产物dLNT-3对肿瘤细胞凋亡的影响较小。4 种Se-LNTs处理后，观察到凋亡细胞比例显著增加。特别是，Se-LNT-2对HCT116细胞的抑制效果最为显著。经Se-LNT-2处理48 h后，HCT116细胞中正常细胞的比例降至18.0%，而晚期凋亡细胞的比例激增至75.1%。这些发现表明，硒对细胞的细胞毒性作用主要与凋亡通路的激活有关，而非坏死过程。

图7 LNTs和Se-LNTs处理HCT-116细胞48 h后的细胞凋亡率

如图8所示，经过24 h的孵育后，LNT和dLNT-3组的高水平活性氧（ROS）含量保持在10%以下。相反，经Se-LNTs处理后，相对高水平ROS含量显著增加。值得注意的是，Se-LNT-2为66.1%，比LNT组高出8 倍。这一观察结果表明，Se-LNT-2显著诱导HCT116细胞中ROS的产生。

图8 LNTs和Se-LNTs处理HCT116细胞24 h后细胞内ROS水平

LNT组中约有5%的细胞表现出低电位（图9A）。经4 种Se-LNTs处理后，线粒体受损明显增加，其中Se-LNT-2的效果最为显著，低电位细胞比例达到62.8%。与对照组相比，HCT116细胞中Caspase-3的活性显著升高，Se-LNT-2组在24 h时增加了328%（图9B）。综上所述，Se-LNTs刺激ROS的产生，由于HCT116细胞的抗氧化能力较弱，细胞内ROS的积累会导致线粒体损伤，降低线粒体膜电位，激活HCT116细胞中的Caspase-3，最终导致细胞凋亡。

图9 LNTs和Se-LNTs处理细胞24 h后HCT116细胞线粒体膜电位低电位相对含量（A）和HCT116细胞中凋亡蛋白酶Caspase-3活性（B）

Conclusion

本研究采用硝酸-亚硒酸钠法对LNT及其降解产物dLNT进行修饰，制备了4 种Se-LNTs。结果表明，硒以亚硒酸酯的形式与LNT的C6位置相连。硒化修饰会导致Mw降低和链刚性增加。这4 种Se-LNTs的细胞摄取机制存在显著差异。随着Mw的降低和链刚性的增加，Se-LNT的细胞摄取率降低，摄取方式从巨胞饮转变为网格蛋白介导的CVME。体外抗肿瘤活性实验显示，LNT和dLNT对HCT116细胞的抑制作用可忽略不计。4 种Se-LNTs表现出明显的抑制作用，其中Se-LNT-1和Se-LNT-2因具有较高的摄取率而显示出更高的抑制率。此外，研究发现Se-LNTs能刺激HCT116细胞产生大量ROS，过量ROS积累使HCT116细胞易受线粒体过氧化损伤，导致线粒体内膜通透性增加。最终，激活凋亡蛋白酶Caspase-3，导致HCT116细胞凋亡，从而产生抗肿瘤效果。

第一作者

贾学伟，博士，硕士生导师。主要研究方向为天然高分子及烟草科学与工程。先后主持参与河南省高校重点科研项目, 河南省科技攻关和国家自然科学基金面上项目等纵向课题和河南中烟、广西中烟、重庆中烟及四川中烟等企业横向课题。获批参加国家留学基金委员会2018年西部地区人才培养特别项目。获得河南省科技进步奖二等奖1项，全国商业科技进步奖三等奖2 项，中国轻工业联合会科技进步奖三等奖1 项。发表SCI论文20余篇，授权发明专利10余件。

通信作者

芦昶彤，硕士，高级工程师，现任河南中烟工业有限责任公司技术中心主任工程师，主要从事卷烟研发和烟草化学等工作，入选首批河南中烟青年专业人才托举计划，荣获“河南省五一劳动奖章”、“河南卷烟工业调香技能大赛第一名”和“河南中烟工业有限责任公司技术能手”等荣誉。工作以来，曾荣获省部级科学技术进步奖4 项，地厅级科学技术进步奖7 项，国家烟草专卖局验收科技成果2 项，授权国家发明专利40余项，实用新型专利10余项，出版论著3 本，在Dalton Transactions、Journal Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy、《烟草科技》《中国烟草学报》、《食品科学》等国内外期刊上发表学术论文40余篇，其中SCI/EI收录论文15 篇。

许春平，博士，教授，博士生导师，河南省“百人计划”特聘专家，陕西科技大学兼职博导，河南省高校科技创新人才，河南省高校科技团队负责人，行业内烟草工业生物技术重点实验室学术委员会委员，四川省、江西省、安徽省科技奖励评审专家，担任Biotechnology and Bioprocess Engineering（SCI收录）与Journal of Biologically Active Product From Nature编委。现任郑州轻工业大学国家烟草局烟草工业生物技术重点实验室副主任，郑州轻工业大学科协副主席。主要从事生物化工和烟草工程研究。近年来，主持国家自然科学基金面上项目1 项、省厅项目8 项和河南中烟、广西中烟、重庆中烟等企业横向课题10余项，发表论文160余篇，其中SCI收录120余篇，中科院一区12 篇、二区20 篇，高被引论文8 篇，担任Process Biochemistry等国际期刊审稿人。出版学术专著10 部，其中英文图书4 部。获得河南省科技进步二等奖1 项，河南省科技进步三等奖3 项，中国烟草总公司科技进步二等奖1 项，河南省教育厅科技成果一等奖2 项，授权国家发明专利16 件。

Impact of molecular weight and chain rigidity on the endocytosis and anti-tumor activity of seleno-lentinan

Xuewei Jia a, Yalong Liu a, Zhifei Chen b, Tianxiao Li a, Changtong Lu b*, Chunping Xu a*

aCollege of Tobacco Science and Engineering, Zhengzhou University of Light Industry, Zhengzhou 450000, China

bTechnical Center, China Tobacco Henan Industry Co., Ltd., Zhengzhou 450000, China

*Corresponding author.

Abstract

This study focused on the modification of lentinan (LNT) and its degradation product, dLNT, through the nitric acid-sodium selenite method, resulting in the synthesis of 4 distinct seleno-polysaccharide (Se-LNTs). The selenium moiety was found to be connected to the C6 position of LNT in the form of selenate. The selenization process led to a notable reduction in molecular weight and an augmentation in chain rigidity. As the molecular weight decreased and chain rigidity increased, the cellular uptake of Se-LNT diminished. Additionally, the uptake pathway transitioned from macropinocytosis to caveolin-mediated endocytosis (CVME). In vitro cell experiments showed that all four Se-LNTs showed obvious anti-tumor activity, and Se-LNT-2 had higher selenium content and cellular uptake rate, showing better inhibitory effect. Furthermore, Se-LNTs were observed to induce a substantial production of reactive oxygen species (ROS) in HCT116 cells. The excessive ROS levels triggered mitochondrial peroxidation damage, escalating mitochondrial inner membrane permeability. This cascade event eventually led to the activation of caspase-3, ultimately leading to apoptosis in HCT116 cells and substantiating the anti-tumor effects of Se-LNTs. The comprehensive investigation into the structural modifications, cellular uptake mechanisms and biological activities of Se-LNTs underscores their potential as promising agents for anti-tumor applications.

Reference:

JIA X W, LIU Y L, CHEN Z F, et al. Impact of molecular weight and chain rigidity on the endocytosis and anti-tumor activity of seleno-lentinan[ J] . Journal of Future Foods, 2025, 5(4): 419-427. DOI:10.1016/j.jfutfo.2024.07.020.

文章翻译由作者团队提供

编辑：龚艺；责任编辑：孙勇

封面图片来源：摄图网

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