斑马鱼行为篇（104）：斑马鱼胚胎研究颅面部发育

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斑马鱼胚胎颅面部的发育异常检测是研究先天性畸形、基因功能以及环境因素对发育影响的重要手段。

饲养严格控制灯光和温度。光照和黑暗的时间比为14 h∶10 h，水体的pH值为7± 0.5，温度在28.5 ℃左右，每天喂食两次丰年虫卵。交配产卵由光照控制。前一天晚上把一公两母三条斑马鱼放在孵化盒中，第二天早上收集鱼卵。鱼卵放于胚胎培养液(0.2 g/L的海盐水+0.01%的亚甲基蓝配置而成)中培养。

考察麦考酚酸对斑马鱼胚胎发育毒性评估

斑马鱼胚胎发育时间用受精后小时(hours post-fer tiliaztion，hpf) 表示。将2 hpf 的胚胎放于24 孔板培养，每孔20个胚胎，孔中预先加入1 mL胚胎培养液。在每孔内分别加入预先配制成不同浓度的，实验期间不更换培养液，一直作用到120 hpf 终止。在72hpf时通过体视倒置显微镜观察并记录每组死亡个数和畸形个数，计算每组胚胎的存活率(存活个数/胚胎总数)和畸形率(畸形个数/胚胎总数)。计算 LC50 (50%的致死浓度)。

将72 hpf的斑马鱼胚胎置于4% 多聚甲醛中固定过夜，依次用50%和100%乙醇进行脱水;配置阿尔辛蓝染液进行染色，摇床过夜;然后在饱和硼酸钠中中和12 h;再置于3%过氧化氢和1%氢氧化钾的混合液中漂白20 min;最后用1%的胰酶消化，去除软骨外其他组织，在100%甘油中使用体式显微镜观察拍照。

异常表现：

• 颅面裂：前脑和中脑之间的裂缝异常。

• 腭裂：上颚和下颚之间的裂缝异常。

• 眼间距异常：眼睛之间的距离异常。

• 鼻孔异常：鼻孔的位置、大小或数量异常。

• 颌骨异常：上下颌骨的发育异常。

• 软骨异常：软骨结构的缺失或变形。

A、B: 24 hpf 对照组和实验组侧面观察;C、D: 72hpf对照组和实验组侧面观察;E、F:120hpf对照组和实验组侧面观察;黑色矩形框内所示为头部区域

斑马鱼在10 hpf进入体节期，此时原始咽弓开始发育;24 hpf 开始进入咽弓期，咽弓迅速发育，下颌和舌弓逐渐形成，到48 hpf原始器官开始出现具体的形态，胚胎开始从卵膜中孵化出来;72 hpf时斑马鱼已进入早幼期，此时可观察到嘴部凸起。24 hpf实验组斑马鱼的头部出现异常的色素沉积，表明药物主要作用部位为头部;72 hpf，斑马鱼发育进入早幼期，嘴部有凸起，但实验组胚胎头部扁小，无法观察到嘴部，下颌发育比较缓慢;120 hpf 的正常斑马鱼胚胎可观察到下颌，嘴部明显突出，而实验组依然头部偏小，下颌无明显凸起。

参考文献：

• McGrath P，Li CQ． Zebrafish: a predictive model for assessing drug-induced toxicity［J］． Drug Discov Today，2008，13( 9/10) :394－401．

• 杨迷芳,马兰,严冬琳,等.麦考酚酸对斑马鱼胚胎颅面部发育的影响[J].口腔医学,2019,39(02):103-107.DOI:10.13591/j.cnki.kqyx.2019.02.002.

• Panzica-Kelly JM，Zhang CX，Danberry TL，et al． Morphological score assignment guidelines for the dechorionated zebrafish teratogenicity assay［J］． Birth Defects Res B Dev Reprod Toxicol，2010，89( 5) : 382－395．

• Kimmel CB，Ballard WW，Kimmel SＲ，et al． Stages of embryonic development of the zebrafish［J］． Dev Dyn，1995，203( 3) : 253－310．

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