中药发1区！Adv Sci：银杏素通过直接靶向STING减轻炎症和衰老

银杏叶提取物已广泛应用于临床治疗中枢神经系统和心血管疾病。越来越多的证据表明，银杏提取物具有抗炎和抗氧化特性，可有效治疗衰老相关疾病。然而，其抗衰老活性的具体成分仍不清楚。银杏素是一种从银杏叶中分离出来的天然双黄酮，已被证明具有多种生物活性。值得注意的是，银杏素对氧化、炎症和DNA损伤具有抑制活性，所有这些都是诱导衰老的主要因素。这些研究都表明银杏素具有显著的抗衰老潜力。

cGAS-STING信号通路是介导DNA免疫反应的主要机制，细胞质中的胞质DNA传感器环状cGAS可以识别并结合来自病毒、细菌及其自身细胞质的DNA，从而导致其激活。最近研究已经确定了cGAS-STING信号通路的异常激活在细胞衰老中的关键作用。多种衰老刺激，例如氧化应激和炎症，可以参与cGAS-STING通路。总之，cGAS-STING通路在细胞炎症和衰老疾病的发病机制中发挥着重要作用，使其成为极具吸引力的药物靶点。

2024年11月19日，中国科学院上海药物研究所张素林/郑明月，中国科学院上海营养与健康研究所肖意传团队在Adv Sci（IF=14.3）上发表了题为“Ginkgetin Alleviates Inflammation and Senescence by Targeting STING”的文章，将银杏叶提取物中的双黄酮成分银杏素确定为一种新型抗衰老剂。利用人工智能模型的预测和随后的生物学评估，发现银杏素与STING蛋白的羧基末端结构域结合，从而在体外和体内抑制 STING激活和信号转导。值得注意的是，银杏素被发现可以缓解衰老小鼠模型的衰老表型并抑制异常激活的STING信号通路。这些发现为利用银杏素和银杏叶提取物治疗衰老和炎症性疾病提供了强有力的理论依据。利用人工智能算法发现银杏素的治疗靶点，为识别天然产物靶点提供了新的视角和范式，凸显了人工智能算法在药物靶点发现方面的广泛潜力。

1、银杏素减轻细胞衰老并改善衰老小鼠多个组织的病理学

银杏提取物已被证明具有抗炎和抗氧化特性，可用于治疗与衰老相关的疾病。然而，具有抗衰老活性的具体成分仍然未知。鉴于银杏素的抗炎和抗DNA损伤特性，作者研究了银杏素在阿霉素(Dox)或电离辐射(IR)诱导的衰老细胞中的潜在抗衰老活性，结果显示银杏素有效缓解了Dox或IR诱导的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)衰老。随后，作者建立了Dox和全身照射(TBI)诱导的体内小鼠衰老模型，结果显示银杏素有效缓解了体内衰老表型，且没有表现出明显的毒性作用。

总之，体内和体外实验结果表明银杏素具有抗衰老特性（图1）。然而，其抗衰老调控作用的具体靶点和分子机制仍有待阐明。

图1 银杏素减轻细胞衰老并改善衰老小鼠多个组织的病理学

2、cGAS-STING通路被预测并确认为银杏素的“靶向”通路

为了阐明银杏素抗衰老作用的机制，作者使用了一种深度学习模型，即基于图卷积网络的药物“on-target”通路预测算法(GDOP)，来预测银杏素潜在的“on-target”信号通路。通过GDOP模型确定的银杏素十大预测“on-target”信号通路。之前报道的银杏素靶向信号通路在模型的预测中排名靠前，例如Wnt通路（排名第1）、氧化途径（排名第8）和MAPK通路（排名第22），证明了模型的预测准确性。此外，排名第7的“STING 介导的宿主免疫反应诱导”信号通路引起了作者的注意。该通路主要由cGAS激活启动，导致炎症细胞因子和I型干扰素的产生。据报道，cGAS-STING 通路的激活与细胞衰老有关，包括SASP的产生、细胞周期停滞和线粒体功能障碍。鉴于银杏素在缓解细胞衰老和改善衰老小鼠病理方面的功效，作者推测银杏素可能通过抑制cGAS-STING信号通路发挥其抗衰老作用。

为了证实该推测，作者用各种免疫刺激剂刺激THP-1衍生的巨噬细胞（THP-1 mφs）和Raw264.7细胞。结果显示银杏素显著抑制了cGAS或STING激动剂诱导的IFNB1、CXCL10、TNF和IL6的上调，但没有抑制RIG-I/MDA5或TLR4激动剂诱导的上调，表明银杏素选择性抑制cGAS-STING信号通路。

考虑到cGAS位于STING上游，且银杏素对cGAS和STING激动剂的激动作用均有显著抑制作用，作者推断银杏素靶向的是STING或其下游成分，而非cGAS。正如预期的那样，银杏素对人类和小鼠cGAS的酶活性没有明显的抑制作用，而是显著抑制STING诱导的IFNB1 mRNA上调。考虑到这些信号成分之间的层级关系，这些结果表明STING 很可能是银杏素的靶标（图2）。

图2 cGAS-STING通路被预测并确认为银杏素的“靶向”通路

3、银杏素直接与STING的羧基末端结构域结合

为了确认银杏素是否直接靶向并结合STING蛋白，作者纯化了小鼠STING(mSTING)的羧基末端结构域、各种人类STING等位基因(hSTINGR232 (WT)、hSTINGR232H (REF)、hSTINGG230A、R293Q (AQ)、hSTINGR293Q (Q))和获得功能突变体hSTING (hSTINGN154S、hSTINGV155M)。使用蛋白质热位移(PTS)发现银杏素有效且剂量依赖性地增强了多种hSTING变体和mSTING蛋白的热稳定性，银杏素还显著提高了获得功能突变 hSTING 蛋白的热稳定性，表明对STING自激活突变体具有潜在的抑制作用。此外，银杏素不影响cGAS蛋白的热稳定性，表明银杏素与cGAS之间没有相互作用。随后，利用表面等离子体共振(SPR)实验评估银杏素与STING蛋白的动力学结合特性。结果表明，银杏素以缓慢结合和缓慢解离的方式结合各种纯化的hSTING和 mSTING蛋白。为了进一步验证银杏素与STING的结合并排除泛测定干扰化合物的可能性，作者采用了等温滴定量热法(ITC) 测定法，结果表明银杏素放热结合hSTINGWT蛋白。最后，使用均相时间分辨荧光(HTRF)实验发现银杏素会与cGAMP竞争结合 STING。这些数据共同表明银杏素直接与STING的羧基末端结构域结合（图3）。

图3 银杏素直接与STING的羧基末端结构域结合

4、银杏素抑制STING激活和信号转导

为了研究银杏素在细胞水平上对STING信号通路的抑制活性，作者利用报告基因分析来评估其对cGAMP诱导的STING激活的影响。结果表明银杏素有效减弱了STING激活诱导的报告信号。同样，银杏素对双链DNA(G3-YSD)诱导的炎性细胞因子和I型干扰素mRNA水平表现出浓度依赖性抑制作用。

为了系统地探索与银杏素抑制STING相关的细胞表型，对THP-1 mφs进行了转录组分析。结果表明，银杏素和cGAMP的联合使用显著抑制了cGAMP刺激的基因的表达，此外，差异基因集富集分析(GSEA)显示，三个最显著下调的基因集是“干扰素γ反应”、“干扰素α反应”和“炎症反应”。这些结果表明银杏素有效抑制了STING通路的激活并减少了各种炎症细胞因子的产生。

然后作者评估了银杏素对STING信号通路激活后关键蛋白磷酸化水平和易位的影响。结果显示银杏素处理可有效抑制THP-1 mφs和Raw 264.7细胞中由各种STING激动剂诱导的STING信号通路激活。具体而言，银杏素处理可显著降低 STING 及其关键下游蛋白（包括 TBK1、IRF3、p65 和 STAT3）的磷酸化水平，表明银杏素可有效抑制 STING 及其下游信号通路。

作者还采用免疫荧光(IF)测定法直观地观察银杏素对下游 IRF3 和p65蛋白定位的影响，发现在cGAMP刺激下激活后，IRF3和p65蛋白在THP-1 mφs中均表现出明显的核转位和聚集，而与银杏素共同处理时，它们分散在细胞质中。这些结果表明银杏素有效抑制了STING通路中下游蛋白的激活和核定位。

鉴于 STING 是一种支架蛋白，在与CDN结合时会募集下游信号蛋白，作者进一步探讨了银杏素如何影响STING信号转运。Co-IP试验表明银杏素可以破坏STING和TBK1之间的相互作用。利用IF试验显示STING激动剂促进了STING和TBK1的核周共定位。然而，银杏素处理后，STING和TBK1均分散在胞浆中，提示STING和TBK1的转位受到抑制。而且，银杏素处理后，STING激动剂GSK3诱导的STING在高尔基体的定位被逆转，分散到细胞内，提示STING的激活和运输受到银杏素的抑制。

综上所述，银杏素影响STING从内质网向高尔基体的转位，从而削弱STING与TBK1的相互作用，进而阻碍STING通路的信号转导（图4）。

图4 银杏素抑制STING激活和信号转导

5、银杏素抑制Trex1−/−小鼠的全身炎症

鉴于银杏素在体外对STING通路具有良好的抑制和选择性，作者接下来研究了它在体内改善STING依赖性自身免疫性疾病的潜力。一部分患有艾卡迪-古蒂埃综合征 (AGS)和系统性红斑狼疮(SLE) 的患者出现 TREX1缺陷，并且与cGAS-STING通路的异常激活密切相关。研究显示，STING缺失可减轻Trex1−/−小鼠严重且致命的自身炎症性疾病，凸显了 STING 在 Trex1 缺陷性疾病发病机制中的关键作用。作者前面的数据证实，银杏素可以直接与 STING 的CDN结合域结合，有效抑制STING的激活和易位，从而抑制下游信号传导并减少炎症细胞因子。因此，作者采用Trex1−/− 小鼠模型进一步证实银杏素在体内对STING通路的抑制作用。

首先，作者评估了银杏素是否能有效抑制Trex1−/−小鼠骨髓来源的巨噬细胞 (BMDM) 中的STING信号传导。正如预期的那样，银杏素治疗显著降低了 Trex1−/− BMDM 中 Ifnb1、Cxcl10、Isg15、Isg56、Il6 和 Il1b 的表达。接着评估其在 Trex1−/−小鼠中的治疗潜力，发现6只未经治疗的Trex1−/−小鼠中有2只死亡，而6只接受银杏素治疗的小鼠无一死亡。此外，银杏素显著抑制Trex1−/−小鼠各组织中Ifnb1、Cxcl10、Isg15、Isg56、Il6、Il1b的上调，缓解炎症表型。体内数据表明银杏素有效缓解了Trex1−/−小鼠的全身炎症，表明其具有改善STING依赖性自身免疫性疾病的潜力（图5）。

图5 银杏素抑制Trex1−/−小鼠的全身炎症

6、银杏素通过抑制cGAS-STING通路发挥抗衰老作用

作者前面的研究表明，银杏素可以有效缓解细胞衰老并改善衰老小鼠多种组织的病理，还成功预测并证实银杏素通过靶向STING抑制cGAS-STING通路的激活。考虑到cGAS-STING通路是衰老的关键调节因子。作者研究银杏素的抗衰老活性是否通过抑制cGAS-STING通路的激活来介导。结果显示TBI诱导的衰老小鼠表现出 STING 信号的强烈激活，cGAS-STING通路中的关键蛋白（包括 STING、TBK1、IRF3、p65和 STAT3）的磷酸化水显著升高，而银杏素能有效缓解衰老小鼠的衰老表型，抑制cGAS-STING通路中关键蛋白异常升高的磷酸化水平。总体而言，这些结果提示银杏素可能通过抑制cGAS-STING通路发挥其抗衰老作用（图6）。

图6 银杏素通过抑制cGAS-STING通路发挥抗衰老作用

总结

为了揭示银杏素抗衰老作用的分子机制，作者采用基于图卷积网络的药物“靶向”路径预测算法进行预测。结果表明，cGAS-STING途径可能是Ginkgetin的潜在靶点。随后的细胞生物学和生物物理数据证实，Ginkgetin直接与 STING 蛋白的羧基末端结构域结合，从而抑制STING激活和信号转导。此外，体内药效学数据表明，Ginkgetin可有效缓解Trex1 −/−小鼠的全身炎症，并抑制衰老小鼠模型中异常激活的 STING 信号传导（图8）。综上所述，本研究利用人工智能算法结合药理学方法，证实STING是银杏素缓解炎症和衰老的关键靶点。重要的是，本研究阐明了银杏叶提取物抗衰老作用的具体成分和分子机制，为其治疗用途提供了坚实的理论基础。

图7 银杏素通过靶向STING减轻炎症和衰老

参考文献

https://doi.org/10.1002/advs.202407222

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