JACS|靶向癌症治疗新策略：ClickRNA-PROTAC技术

9月25日，清华大学李景虹院士研究团队在《Journal of the American Chemical Society》期刊上发表了重要研究成果，该研究团队开发了一种ClickRNA-PROTAC系统，该系统通过mRNA转染表达E3泛素连接酶SIAH1和SNAPTag的融合蛋白，并使用生物正交点击化学招募靶蛋白（POI）。该策略只需更换弹头分子，即可有效降解BRD4、KRAS、NF-κB等多种蛋白质。ClickRNA-PROTAC克服了不同肿瘤之间E3酶表达水平差异的限制，拓展了PROTAC技术的应用范围（图1）。

图1 ClickRNA-PROTAC系统作用机制示意图

目前，临床阶段的PROTAC药物主要通过招募E3泛素连接酶VHL和CRBN来介导靶蛋白的泛素化，从而实现蛋白降解。然而，由于不同肿瘤中E3泛素连接酶的表达水平存在差异（图2），这限制了PROTAC药物在癌症治疗中的应用范围和疗效。此外，PROTAC分子缺乏对肿瘤的特异性，可能会在正常细胞中引起靶蛋白的降解，从而对正常细胞造成损害，并可能产生不良副作用。因此，迫切需要开发不依赖内源性E3连接酶的肿瘤选择性PROTAC药物。

图2 13种具有代表性的E3泛素连接酶在不同肿瘤中的相对表达量热图

01

HaloPROTAC系统

共价自标记标签（Self-labeling protein tags, SLPs）是一种蛋白质工程技术，它允许特定的蛋白质在活细胞中被标记，用于生物成像、蛋白质纯化和功能探究等。这些标签通过与目标蛋白质融合表达，并通过特定的配体小分子共价结合，实现对目标蛋白质的标记。目前，已经发展出多种共价自标记标签系统，如HaloTag、SNAP-tag和CLIP-tag等。这些标签系统各有特色，例如：HaloTag基于细菌脱卤酶的突变体，通过亲核的天冬氨酸残基与标记的氯烷烃配体形成稳定的共价键，SNAP-tag可以特异性识别并与苄基鸟嘌呤（BG）反应，形成稳定的共价键，而CLIP-tag可以与SNAP-tag互补使用，特异性识别苄基胞嘧啶（BC）并与之反应，适用于双重标记。共价自标记标签可以通过基因编码的标记蛋白选择性地调节细胞内蛋白之间的相互作用，与PROTACs的原理非常吻合。

2015年，Crews教授团队报道了HaloPROTACs，研究人员将HaloTag技术引入到PROTAC的研究中，建立了HaloPROTAC系统（图3）。HaloPROTAC利用E3连接酶配体与氯烷结合来介导融合蛋白的降解。目前，已有多种类型的基于VHL E3配体以及cIAP配体的HaloPROTAC被广泛用于各种融合靶蛋白的降解。然而，目前报道的方法旨在调节外源蛋白的表达和降解，而不是靶向降解肿瘤相关蛋白，肿瘤选择性PROTAC药物的研发市场仍是一片空白。

图3 HaloPROTAC的技术原理

02

mRNA疗法

mRNA疗法是一种革命性的技术，它通过利用mRNA来指导细胞产生治疗性蛋白，展现出治疗多种疾病的潜力。自从mRNA新冠疫苗成功应用于临床以来，mRNA技术在疫苗开发和疾病治疗方面取得了显著进展（图4）。在疫苗开发方面，mRNA技术正在被用于开发针对流感、巨细胞病毒（CMV）和呼吸道合胞病毒（RSV）的疫苗。mRNA疫苗的优势在于它们可以快速设计和生产，以应对快速变异的病原体。

在疾病治疗方面，研究人员正在探索使用mRNA表达治疗性蛋白来治疗遗传性疾病、心血管疾病等。例如，mRNA可以被用来表达血管内皮生长因子（VEGF）来治疗心力衰竭。此外，mRNA也被用于CRISPR-Cas9等基因编辑技术，以治疗遗传性疾病。CRISPR/Cas9系统可以由Cas9蛋白和单链导向RNA（sgRNA）组成，通过sgRNA的导向作用在特定靶部位切割靶基因，实现基因编辑。在肿瘤靶向治疗方面，研究人员正在开发以细胞类型特异性方式调节mRNA编码蛋白翻译的方法。例如，合成的内含子可以被肿瘤细胞中的剪接因子突变激活，导致肿瘤细胞靶向剪接和mRNA的表达。此外，由腺苷脱氨酶RNA特异性（ADAR）介导的mRNA碱基编辑策略，称为CellREADR，可以以细胞特异性的方式诱导Ato-I对停止密码子UAG进行碱基编辑，从而激活下游蛋白的翻译。然而，这些方法尚未用于肿瘤靶向mRNA治疗的开发。

图4 主要RNA研究和发展里程碑的时间表

03

ClickRNA-PROTAC系统

9月25日，清华大学李景虹院士研究团队开发了一种新型蛋白质降解技术ClickRNA-PROTAC，它结合了mRNA转染和PROTAC技术。该技术通过转染mRNA在活细胞中表达共价标签的E3泛素连接酶融合蛋白，并通过二苯基环辛炔（DBCO）修饰的配体使融合蛋白功能化，再利用点击化学将叠氮化合物偶联的POI配体连接到融合蛋白上，诱导POIs泛素化并降解。为了实现肿瘤特异性，该技术采用了基于UAG终止密码子的AI碱基编辑策略，调控mRNA的翻译。合成的mRNA由5′传感区和3′蛋白编码区组成，中间有一个UAG终止密码子，以防止初始状态下3′蛋白编码区翻译。在肿瘤细胞中，5′传感区与肿瘤特异性mRNA杂交，激活ADAR介导的A到I碱基编辑，使得原本的终止密码子UAG变为可翻译的UIG密码子，从而重新激活3′蛋白质编码区的翻译。研究人员构建了52种不同的Tag-E3融合蛋白，并在HEK293FT细胞中验证了它们的表达水平。其中，SIAH1-SN、VHL-HC和PARKIN-HN等16种融合蛋白表达良好，能有效降解BRD4蛋白（图5）。

图5 ClickRNA-PROTAC设计方案及Tag-E3融合蛋白和叠氮共轭配体的构建与优化

ClickRNA-PROTAC系统通过mRNA形式递送，能有效降解KRAS和p65蛋白，且具有剂量依赖性。此外，该技术还能特异性激活肾上腺皮质癌效应蛋白的翻译，而不影响正常细胞。在裸鼠肿瘤模型中，ClickRNA-PROTAC显著抑制了肿瘤生长，且与传统的PROTAC相比，具有更优越的抗肿瘤效果（图6）。治疗后小鼠的主要脏器未发现明显组织损伤，表明ClickRNA-PROTAC具有较好的安全性和选择性。

图6 ClickRNA-PROTAC靶向蛋白降解能力以及体内肾上腺皮质癌的靶向治疗

04

结语

ClickRNA-PROTAC技术展现了高效降解靶蛋白的能力，并且具备几大显著优势：它不依赖于细胞内源的E3泛素连接酶，能够实现肿瘤细胞的选择性作用，并且具有高度的可编程性。这些特性为PROTAC药物的研发和其在临床上的潜在应用开辟了新的道路。总体而言，ClickRNA-PROTAC技术代表了一种治疗肿瘤的创新策略，它通过精确降解肿瘤细胞内的特定蛋白质靶标，有潜力发展成为一个有效的临床治疗方案。

Ref.

[1] Mo J, Chen J, Shi Y, Sun J, Wu Y, Liu T, Zhang J, Zheng Y, Li Y, Chen Z. Third-Generation Covalent TMP-Tag for Fast Labeling and Multiplexed Imaging of Cellular Proteins. Angew Chem Int Ed Engl. 2022 Sep 5;61(36):e202207905. doi: 10.1002/anie.202207905.[2] Buckley DL, Raina K, Darricarrere N, Hines J, Gustafson JL, Smith IE, Miah AH, Harling JD, Crews CM. HaloPROTACS: Use of Small Molecule PROTACs to Induce Degradation of HaloTag Fusion Proteins. ACS Chem Biol. 2015 Aug 21;10(8):1831-7. doi: 10.1021/acschembio.5b00442.[3] Sasso JM, Ambrose BJB, Tenchov R, Datta RS, Basel MT, DeLong RK, Zhou QA. The Progress and Promise of RNA Medicine─An Arsenal of Targeted Treatments. J Med Chem. 2022 May 26;65(10):6975-7015. doi: 10.1021/acs.jmedchem.2c00024.[4] Teng X, Zhao X, Dai Y, Zhang X, Zhang Q, Wu Y, Hu D, Li J. ClickRNA-PROTAC for Tumor-Selective Protein Degradation and Targeted Cancer Therapy. J Am Chem Soc. 2024 Sep 25. doi: 10.1021/jacs.4c06402.

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