Cell丨调控REM的核心环路？最新研究揭示对REM睡眠至关重要的脑桥-髓质回路及其在帕金森病中的缺陷

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哺乳动物的睡眠包括快速眼动睡眠(REM)和非快速眼动睡眠(NREM)。NREM的特征是脑电图(EEG)的高振幅慢波振荡，反映皮层神经元在去极化上升状态和超极化下降状态之间的同步转变。相比之下，REM的特点是皮质神经元的平均放电率增加，脑电图中的快速振荡和θ波，骨骼肌活动的丧失(肌肉张力失调)。脑干神经元异质性使REM睡眠回路的研究充满挑战。

2024年9月19日，日本筑波大学国际综合睡眠医学研究所Yu Hayashi团队在Cell杂志上发表题为《A pontine-medullary loop crucial for REM sleep andits deficit in Parkinson’s disease》的论文，该研究发现脑桥嗅觉下被盖(SubLDT)中表达促肾上腺皮质激素释放激素结合蛋白(Crhbp+神经元)并投射到髓质的神经元促进快速眼动睡眠。在接受Crhbp+神经元投射的髓质区域内，表达一氧化氮合酶1 (Nos1+神经元)的神经元投射到SubLDT并促进快速眼动睡眠，表明脑桥和髓质之间存在积极的相互作用回路，是快速眼动睡眠的核心回路。

• Crhbp - cre小鼠的产生

在SLD内，在REM期间最活跃的谷氨酸能神经元主要分布在嗅觉下被盖(SubLDT)，或SLD中含有胆碱能神经元的吻侧部分。在此，基于作者之前的转录组学分析，作者专注于促肾上腺皮质激素释放激素结合蛋白(Crhbp)。原位杂交显示，Crhbp在SubLDT中高表达，在LDT和 VT核团也有少量表达。作者引入了Crhbp-cre (Crhbp-P2A-Cre-pA)敲入小鼠，在很大程度上再现了内源性Crhbp表达模式。在SubLDT中表达Crhbp的神经元(Crhbp+ SubLDT神经元)要么共表达囊泡GABA转运蛋白(Vgat: Slc32a1)，要么共表达囊泡谷氨酸转运蛋白2 (Vglut2: Slc17a6)，表明这些神经元要么是GABA能的，要么是谷氨酸能的。

• Crhbp+ S,L,V神经元的消融减少了REM期间的睡眠并损害了肌肉张力

为了测试Crhbp+神经元参与睡眠调节，作者通过病毒注射消融了SubLDT及其邻近区域、LDT和VT的Crhbp+神经元(Crhbp+ S、L、V神经元)。作者记录脑电图和肌电图(EMG)来测量睡眠。Crhbp+ S、L、V神经元的消融减少了在REM和NREM中花费的时间，同时增加了清醒时间。此外，Crhbp-Cre组在REMS期间表现出更高的肌电积分值，表明这些神经元也在REMS期间调节肌肉张力。因此，谷氨酸能Crhbp+ S、L、V神经元参与了REMS和NREMS的正向调节以及REMS期间肌肉张力的表达。

• Crhbp+ SubLDT神经元的投射靶向

作者检测了Crhbp+ SubLDT神经元的轴突投射模式。作者将cre依赖性表达突触前蛋白synaptophysin与GFP融合的AAV (AAV.1- hsyn -flex- tdtomato -2A-synaptophysin-GFP)单侧注射到Crhbp- cre小鼠的SubLDT中。在中隔、基底前脑(BF)、丘脑中背侧、下丘脑、背侧中脑深部核(dDpMe)和髓质的广泛区域，包括巨细胞网状核(Gi)和副巨细胞核检测到GFP信号。

• Crhbp+ SubLDT /Gi神经元促进REMS

作者测试了Crhbp+ SubLDT神经元是否根据其投射不同而具有不同的作用。

作者之所以关注Gi-突起的神经元，是因为Gi腹侧区域与REM期间肌肉张力失调所必需的抑制性神经元的分布部分重叠。作者通过化学遗传方法操纵Crhbp+ SubLDT神经元(Crhbp+ SubLDT /Gi神经元)，发现当这些神经元在ZT 5的光照阶段被CNO化学激活时，REMS以觉醒为代价增加，导致REMS占总睡眠的比例增加。

作者接下来通过纤维光度法测量自发睡眠-觉醒周期中表达jGCaMP7s的Crhbp+ SubLDT /Gi神经元钙活动。结果发现，在REMS期间神经元活动最大。在各警戒状态间的转换过程中，从NREM到REMS、从NREM到wake的荧光信号增加，从wake到NREM的荧光信号减少。在REM到wake转换期间，信号变化不大。

• Crhbp+ subLDT /BF神经元促进NREMS

作者研究了操纵Crhbp+ SubLDT神经元投射到BF的效果(Crhbp+ SubLDT /BF神经元)。基于Vgat的表达，大多数Crhbp+ SubLDT /BF神经元为gaba能神经元。当作者化学激活这些神经元时，NREMS增加，同时在光期(ZT5)和暗期(ZT17)觉醒时间和REMS与总睡眠比例降低。与Crhbp+ SubLDT /Gi神经元相比，Crhbp+ SubLDT /BF神经元的化学激活不会影响REMS期间的肌肉张力。

通过纤维光度法测量的神经元群体活动发现在清醒期间神经元活性最高。在各个警戒状态之间的转换过程中，从NREMS到REMS、从NREMS到wake、从REMS到wake的荧光信号增加，而从wake到NREMS的荧光信号减少。考虑到Crhbp+ SubLDT /BF神经元的化学激活诱导了NREM，并且Crhbp+ SubLDT /BF神经元在清醒时是活跃的，这些神经元可能参与了抑制清醒的过程。

• CamkIIa+ DPGi、Pr神经元通过投射到SubLDT促进REMS

为了探索促REMs的Crhbp+ SubLDT /Gi神经元上游的神经元，作者进行了狂犬病毒(RV)追踪。在参与REMS调节的dDpMe、外侧副巨核(LPGi)、背侧副巨核(DPGi)和前体舌下核(Pr)中检测到gfp阳性神经元。最近的研究表明， DPGi和Pr中的gaba能神经元，促进REM，而DPGi中的另一个谷氨酸能神经元亚群在REM期间以不影响REM的数量的方式调节REMS。作者还发现，投射到Crhbp+ SubLDT /Gi神经元的DPGi/Pr神经元可以被携带CamkIIa启动子的AAV标记。同样，当作者将AAV.8-CamkIIa-GFP注入WT小鼠DPGi/Pr时，在SubLDT中检测到gfp标记的轴突，表明投射到SubLDT的DPGi/Pr神经元可以被CamkIIa启动子标记(以下简称CamkIIa+ DPGi,Pr神经元)。

为了从功能上抑制CamkIIa+ DPGi,Pr神经元对SubLDT的输入，作者将携带AAV的蓝光激活氯通道注入DPGi/Pr，并在右侧SubLDT上方放置一根光纤，同时通过表达DTA消融左侧SubLDT的神经元。在蓝光照射的4小时内， REMS时间缩短；相反，在光(ZT5)或暗(ZT17)阶段，CamkIIa+ DPGi,Pr神经元投射到SubLDT的化学激活增加了REMS。

• Nos1+ DPGi、Pr神经元对REMS有强烈的促进作用，并投射到多个涉及REMS的区域

在DPGi/Pr中，作者接下来关注一氧化氮合酶1 (Nos1)，因为作者注意到它在DPGi/Pr中表达丰富。作者检测CamkIIa+ DPGi、Pr神经元是否共表达Nos1。大部分tdtomato阳性的Nos1+ DPGi,Pr神经元与CamkIIa+ DPGi,Pr神经元重叠。采用化学遗传学激活Nos1+ DPGi,Pr神经元，作者发现以NREMS为代价增加了REMS，导致REMS与总睡眠的比例增加。Nos1+ DPGi、Pr神经元的促rem作用似乎比CamkIIa+ DPGi、Pr神经元更强，说明Nos1在DPGi/ Pr中标记促rem神经元的特异性或效率更高。

作者接下来研究了Nos1+DPGi,Pr神经元的下游靶点。在脑桥中，tdTomato标记的轴突主要在SubLDT中被检测到，这与REMS诱导过程中SubLDT和DPGi/Pr之间的相互投射模型相一致。此外，tdTomato标记的轴突在包括副内侧核、中线背外侧核、中央中线内侧核、中央前外侧核、外侧背外侧核和外侧前内侧核在内的脑干广泛区域以及丘脑的多个核团中被检测到。tdTomato信号也在眼球运动核、下丘脑的前视前核和中线核中被检测到。综上所述，这些发现揭示了一个由脑桥和髓质之间的相互反馈环路和从髓质到前脑的投射组成的REMS诱导环路。

• PD合并RBD模型鼠CRHBP-IR神经元的选择性丢失

与PD相关的睡眠症状，包括REMS期间的肌肉松弛障碍和REMS/慢波睡眠减少，与Crhbp+ S、L、V神经元缺失的小鼠表型相匹配。在确定Crhbp是睡眠调节神经元的标志物后，作者研究了这些神经元是否在有RBD的PD模型鼠中受到影响。作者免疫组织化学分析观察到一个区域的乙酰胆碱能和去甲肾上腺素能神经元分布稀疏，与小鼠SubLDT类似。此外，作者在该区域检测到了CRHBP免疫反应阳性（CRHBP-IR）神经元。PD模型鼠的RBD组中该区域的CRHBP-IR神经元数量较对照组减少。相反，胆碱能神经元的数量没有显著减少，这表明特定的CRHBP-IR神经元丢失。作者还发现PD模型鼠CRHBP-IR神经元中存在磷酸化的S129-α突触核蛋白的积累，这表明Crhbp+ SubLDT神经元容易发生α突触核蛋白聚集，这可能解释了PD模型鼠这些神经元的特异性丢失。这些结果强烈表明，Crhbp+ SubLDT神经元功能障碍与PD的快速眼动行为障碍（RBD）和其他睡眠相关症状有关。

总结

虽然人们普遍认为SLD在REMS调节中起着关键作用，但由于神经元的异质性，其背后的神经元类型尚未得到确认。在这项研究中，分子标记物与投射目标分析的结合使我们能够识别出Crhbp+ SubLDT/Gi神经元是REMS诱导神经元，这进一步使我们能够识别出包括DPGi/Pr和SubLDT在内的REMS诱导环路。除了Crhbp+ SubLDT/Gi神经元外，激活CamkIIa+ DPGi,Pr神经元在光暗相中强烈诱导REMS。CamkIIa+ DPGi,Pr神经元包含谷氨酸能和抑制性神经元，两种亚型对于REMS都是至关重要的。CamkIIa+ DPGi,Pr神经元很可能激活Crhbp+ SubLDT/Gi神经元和其他尚未确定的促进REMS的SubLDT神经元，这可能是通过释放某些兴奋性神经调质实现的。作者将Nos1确定为REMS诱导的CamkIIa+ DPGi,Pr神经元的候选分子标记物。这些神经元强烈投射到SubLDT，它们的激活会显著增强REMS。

CRHBP+ SubLDT/Gi神经元向DPGi/Pr投射，这表明在SubLDT和DPGi/Pr的REMS促进神经元之间存在相互的正反馈作用。这种正向相互作用可能允许在从NREMS过渡到REMS以及随后的REMS期间，快速而可靠地激活这两个区域的REMS促进神经元，并使其在整个REMS发作期间持续活动。作者还发现，CRHBP+ SubLDT/Gi神经元接收来自dDpMe/中脑旁核（vlPAG）的投射，该区域含有强烈抑制REMS的GABA能神经元。来自dDpMe/vlPAG的输入可能对于维持清醒和/或NREMS状态至关重要。

简言之，脑干、脑桥和髓质中产生的神经元回路强烈地诱导快速眼动睡眠，即使在清醒的小鼠中也是如此。此外，帕金森氏症(一种以严重的快速眼动睡眠异常为特征的神经退行性疾病)模型鼠失去了该回路中的一个神经元亚群。

https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.08.046

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