Nat Commun︱大脑隐藏角落CLA如何参与协调致幻体验？

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大脑中有一个叫“屏状核/背侧内嗅皮层复合体”（Claustrum/dorsal endopiriform cortex complex, CLA）的区域，这是一种薄片状灰质结构，具有广泛的轴突投射网络，包裹整个同侧皮层，因此其也被假设是负责感知意识的主要大脑区域，在注意力控制、慢波睡眠、抑郁样行为和疼痛处理等多个方面中起关键作用。CLA向大脑多个皮层区域发送大量的谷氨酸神经递质信号，目标包括抑制性和兴奋性神经元。有研究表明，CLA富含精神活性物质（致幻剂和阿片类致幻物质）的受体，如5-羟色胺受体2a（5-hydroxytryptamine receptor 2 A, 5HT2AR）、5-羟色胺受体2c（5-hydroxytryptamine receptor 2 C, 5HT2CR）和kappa阿片受体（kappa opioid receptor, κOR），可能具有介导致幻的作用。因此，CLA的连接性和受体丰富性使其成为介导中枢神经系统中对幻觉药物产生作用的关键结构。CLA还有一个区域特征为Nurr1（Nur receptor-related 1，或称为Nr4a2）的转录因子在其中表达量很高，Nurr1也成为CLA的细胞识别标记，但它在该区域的作用尚不清楚。已知Nurr1在中脑多巴胺（DA）神经元的发育和调节多巴胺能分子表型特征的基因中起作用，人类Nurr1基因的突变与多巴胺反应性肌张力障碍帕金森病有关。

卡罗林斯卡学院的Ioannis Mantas团队在Nature Communications发表论文Claustrum and dorsal endopiriform cortex complex cell-identity is determined by Nurr1 and regulates hallucinogenic-like states in mice，通过基因敲除生成了CLA神经元中缺乏Nurr1的小鼠模型，以探究Nurr1在CLA中的作用。通过成像和电生理手段，观察了这些小鼠模拟人类幻觉状态的脑活动变化，发现这些小鼠在额叶皮层（PFC）的脑血流量减少、神经网络间功能连接增强以及脑电图（electroencephalography, EEG）全局一致性降低，这些指标与人类的幻觉体验相关。

图源 Nature Communications

首先，研究人员通过原位杂交技术在多种哺乳动物物种（包括人类、恒河猴和啮齿动物）的CLA中检测到Nurr1 mRNA，发现其表达在岛叶和纹状体之间区域浓度高，并且在灵长类动物和啮齿动物中保守。与其他富含Nurr1的脑区相比，CLA中的Nurr1基因表达受到Nurr1基因拷贝数的调节。在Nurr1杂合子敲除小鼠中，CLA、layer 6b (L6b)L6b和下托subiculum的Nurr1转录本密度与Nurr1基因拷贝数成正比，而海马体和腹侧中脑的Nurr1 mRNA水平似乎补偿了Nurr1基因的一个等位基因的缺失，即Nurr1基因表达在CLA受到基因剂量影响。

图1 CLA中的Nurr1 mRNA在物种间是保守的，并且依赖于Nurr1基因的剂量

为了研究Nurr1在CLA中的转录作用，研究人员利用腺相关病毒（adeno-associated viruses, AAVs）在条件性Nurr1基因敲除小鼠（Nurr1-flx）的CLA中注射了编码绿色荧光蛋白（GFP）或Cre融合GFP的基因。结果表明，Nurr1基因敲除小鼠的CLA中缺乏Nurr1 mRNA和蛋白。通过空间转录组学（spatial transcriptomic, ST）分析，研究人员发现Nurr1缺失导致CLA基因表达谱发生显著变化，Nurr1缺失导致CLA区域基因表达谱发生改变，并导致CLA区域在空间转录组学图谱中的位置发生变化。此外，通过对空间转录组数据进行去卷积分析，研究人员发现Nurr1缺失导致CLA区域特异性基因表达的丢失。

图2 Nurr1的缺失改变了侧脑室的转录组特征

通过基因表达分析、聚类分析和原位杂交技术，发现多个CLA特异性基因（如Gnb4、Gng2、Rgs12、Oprk1等）在Nurr1基因敲除小鼠中显著下调。这些基因在CLA区域的表达减少也通过免疫荧光实验得到证实。值得注意的是，包括5HT2AR和5HT2CR在内的其他致幻剂受体也富集在CLA区域，并且在Nurr1基因敲除小鼠中也表达下调，即Nurr1基因缺失会导致CLA区域中富集的基因表达下调。

图3 CLA中Nurr1的丢失减少了CLA富集基因的表达

由于许多富含CLA基因发生了剧烈的变化，研究人员提出质疑：Nurr1缺失是否会影响CLA皮层投射神经元的完整性。为了评估这个问题，研究人员在野生型WT和Nurr1-flx小鼠的PFC中注射了携带编码Cre的转基因（rgAAV-Cre）的逆行AAV（carried transgenes encoding Cre, rgAAV-Cre）。实验发现，尽管Nurr1在CLA中的表达减少，但WT和Nurr1缺失小鼠中都存在GFP标记的CLA神经元。此外，研究人员使用D1R-Cre小鼠模型，在CLA神经元中敲除Nurr1，同时保持其他脑区Nurr1表达。结果表明Nurr1在CLA中的表达减少，但CLA神经元并没有丢失。通过荧光标记和逆行性病毒注射等方法，研究人员进一步证实，Nurr1缺失不会影响CLA-PFC映射的完整性。

通过行为学实验研究发现，D1R-Nurr1cKO小鼠在Y迷宫自发交替测试和被动回避任务中表现正常，表明CLA中Nurr1的缺失不会导致坚持或疼痛回避学习缺陷。在听觉注意力方面，D1R-Nurr1cKO小鼠在存在听觉干扰的情况下，牛奶摄入量和进食延迟与野生型小鼠没有显著差异。此外，D1R-Nurr1cKO小鼠在预脉抑制测试中表现正常，证实了其听觉注意力的完整性。在抑郁样行为的啮齿动物模型中，D1R-Nurr1cKO小鼠在蔗糖偏好测试和强迫游泳测试中表现也未见异常。

图4 CLA中Nurr1的缺失不会影响闭锁皮质的投射

研究发现，敲除D1R-Nurr1cKO小鼠中，与CLA相关的基因表达显著下调，包括Cadps2、Synj1、Rgs12等，以及CLA富集基因Ntng2和Sema5b，放射性ISH实验也证实了CLA标志物Gnb4、Sstr2、Ntng2、Slc17a6和Bdnf在D1R-Nurr1cKO小鼠中的减少。与AAV-Nurr1cKO成年小鼠相似，D1R-Nurr1cKO小鼠中CLA富集的致幻受体5HT2AR、5HT2CR和κOR也减少。这些研究还说明，尽管D1R-Nurr1cKO小鼠中L6b的Nurr1表达减少，但5HT2AR的mRNA密度没有显著变化，而Tmem163作为CLA和L6b的共同标志物，在D1R-Nurr1cKO小鼠中CLA表达显著减少，但L6b表达没有改变，表明L6b分子特性在该小鼠模型中得以保留。这些结果表明，Nurr1在维持CLA神经元的转录特性中起着至关重要的作用。

图5 D1R-Nurr1cKO小鼠表现出CLA富集基因表达减少

Nurr1基因缺失导致5HT2AR和κOR受体在CLA的表达减少，从而导致这些受体激动剂在该脑区无法引发基因转录和电生理反应。具体来说，DOI（5HT2R激动剂）在对照组小鼠中可上调CLA中的Fos和Arc基因表达，并导致5HT2AR的内在化（internalization）出现，但在D1R-Nurr1cKO小鼠中则没有观察到这些效应。U69（κOR激动剂）可抑制对照组小鼠CLA的场兴奋性突触后电位（field excitatory postsynaptic potentials, fEPSP）幅度，但在D1R-Nurr1cKO小鼠中则没有出现类似的抑制作用。这些结果表明，Nurr1在CLA中对5HT2AR和κOR的表达至关重要，并且Nurr1缺失会影响这些受体介导的信号通路。

为了进一步研究多巴胺能兴奋剂（如可卡因）诱导的Arc的上调和过度活动。对D1R- nurr1cko小鼠CLA中D1R的表达进行检测，研究发现D1R-Nurr1cKO小鼠的CLA中D1R的mRNA未发生变化，并且在可卡因治疗7天后，CLA中Arc未出现显著上调。尽管这些小鼠在背内侧侧坐核dorsomedial中表现出与基因型无关的Arc表达治疗效应，但在开阔场测试中，D1R-Nurr1cKO小鼠表现出平均活动速度增加，这可能是与CLA无关的副作用。尽管抑制CLA可以减少对可卡因的运动反应，但研究发现，D1R-Nurr1cKO小鼠对可卡因（10mg/kg）的运动反应没有显著差异。此外，对苯丙胺（AMPH，5mg/kg）和苯环丁烷（PCP，8mg/kg）的急性运动反应也没有观察到显著的基因型差异。

图6 D1R-Nurr1cKO抑制了CLA中致幻剂受体诱导的效应

研究人员利用药理学功能超声（pharmacological functional ultrasound, pfUS）技术，观察了Nurr1缺失小鼠在5HT2R和κOR激动剂作用下的脑血容量（cerebral blood volume, CBV）和功能连接变化（fc）。结果表明，DOI和U69这两种激动剂均可降低前额叶皮层PFC的CBV信号，并增加PFC和感觉运动网络SM之间的fc，但这些效应在Nurr1缺失小鼠中减弱。此外，电生理记录显示DOI可降低Ctrl小鼠PFC和SM之间的单位放电率相关性，而Nurr1缺失小鼠则表现出相反的趋势。这些结果表明，Nurr1介导的5HT2R和κOR受体表达对于5HT2R和κOR激动剂诱导的PFC的CBV变化和fc变化至关重要。

图7 CLA中Nurr1缺失影响致幻剂受体激动剂对皮质功能连通性的影响

这项系统性研究发现，Nurr1在CLA中的缺失会降低5-HT2R和κOR激动剂诱导的皮质功能连接性的变化，表明CLA可能是介导致幻觉状态的连接性变化的关键脑区。尽管Nurr1缺失会降低CLA中许多特异性基因的表达，但并不影响小鼠在特定行为任务中的表现，可能是因为Nurr1的缺失并不直接抑制CLA的功能，而是通过引起大规模转录变化来限制CLA的调节作用。CLA可能在幻觉体验中发挥协调作用，而不是作为介导幻觉的主要大脑区域。尽管致幻剂会引起多种大脑变化，但CLA可能是海洛因能和阿片样致幻受体的汇聚点。这项研究为进一步探索CLA在大脑功能中的作用提供了新的实验策略。

在这个系统性的研究中，涉及到多个动物行为学实验研究，例如Y迷宫实验（Y-maze）、被动回避实验（Passive avoidance testm, PAT）、喂养时加入噪音干扰实验、预脉冲抑制实验（Pre-pulse inhibition test, PPI）、强制游泳实验（Forced swim test, FST）、糖水偏好实验（Sucrose preference test, SPT）、头部抖动反应实验（Head twitch response, HTR）、开放场实验（Open field test, OFT）。

Y迷宫实验是一种常用于评估小鼠自发性探索行为和空间工作记忆的行为学实验。在该实验中，小鼠被放置在一个对称的Y形迷宫中央，每个臂长40cm、宽8cm、高20cm。实验过程中，小鼠的活动轨迹由悬挂在上方的摄像头记录10分钟。实验的主要指标是小鼠在连续的三臂进入序列中进入三个不同臂的次数,即自发交替次数，计算方法是将自发交替次数除以总臂进入次数减2得到自发交替百分比。这一指标反映了小鼠在探索新环境时的自发性和工作记忆能力。正常小鼠在Y迷宫中会表现出较高的自发交替百分比，因为它们倾向于探索新的臂而不是重复进入之前进入过的臂。该实验简单易行，可以重复进行，并且对于评估小鼠的认知功能和情绪状态具有良好的预测性。

被动回避实验PAT是一种常用于评估小鼠学习和记忆能力的行为学实验。在该实验中，小鼠首先被放置在一个明亮的隔间中60秒，然后一个滑动门打开，小鼠进入一个黑暗的隔间（训练潜伏期）。当小鼠全身进入黑暗隔间后，门自动关闭并给予一个弱电刺激（0.3mA，持续2秒），并在刺激后立即记录小鼠的叫声（包括叫声次数和振幅）。24小时后，小鼠再次被放置在明亮隔间，测量其返回黑暗隔间的潜伏期（保留潜伏期）。该实验利用小鼠对黑暗环境的自然偏好，通过给予不愉快的电刺激来建立小鼠对黑暗环境的被动回避学习。训练潜伏期反映了小鼠进入黑暗隔间的速度，而保留潜伏期则反映了小鼠对之前学习到的回避记忆的保持。此外，实验还记录了小鼠在电刺激后的叫声反应，这可以作为评估小鼠情绪状态的指标。

在预脉冲抑制实验中，小鼠首先在实验箱中适应5分钟的背景噪音（65dB）。然后进行4个实验块，每个块包含10个不同类型的试次；第一和第六个块包含5个单纯的强刺激（120dB，40ms）试次；第二和第三个块则包含4种不同类型的试次：单纯强刺激试次，以及在强刺激前分别加入20ms的弱预脉冲（68dB、71dB或77dB）的试次。这些试次以伪随机顺序呈现。整个实验持续23分钟，共包含60个试次。实验过程中，小鼠的惊跳反应通过连接在实验箱底座的压电传感器检测并记录。PPI的计算方式是：在加入预脉冲刺激时的惊跳反应幅度与单纯强刺激时的惊跳反应幅度之比。这一指标反映了小鼠对强刺激的感觉运动抑制能力，是评估感知、注意和信息处理功能的重要指标。

在头部抖动反应实验中，小鼠首先在空笼子中适应10分钟，然后，小鼠被分为两组，一组接受生理盐水注射，另一组接受DOI（1mg/kg或8mg/kg，腹腔注射）注射。注射后立即将小鼠放入空笼子中，并用摄像机记录10分钟。至少两名观察者会在10分钟内计算小鼠头部出现的明显、快速、振荡性头部运动，即HTR。HTR实验可以用于评估海洙素类药物（如DOI）对小鼠行为的影响。海洙素类药物可以激活5-HT2A受体，从而诱发HTR行为。通过比较接受生理盐水和DOI注射的小鼠的HTR反应，可以了解药物对小鼠感知、注意和信息处理功能的影响。

https://www.nature.com/articles/s41467-024-52429-9#Sec11

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