Nat Cell Biol | 何康敏团队揭示新的囊泡循环机制

内吞（endocytosis） 是将细胞外的营养物质、细胞膜受体、脂类等通过细胞膜运输进入细胞的囊泡运输过程，大部分物质在内吞后会被运送到早期内体 （early endosome） 进行分选。约70-80%的内吞后的膜蛋白如受体、通道蛋白和转运蛋白等，会通过循环途径 （recycling） 再次回到细胞膜。内吞和循环对细胞的生存、稳态和环境交流等至关重要，内吞和循环的紊乱与癌症和神经退行性疾病等多种人类疾病密切相关。

哺乳动物细胞可通过不同途径实现受体等的循环，包括广泛研究的“快速”和“慢速”循环途径。“快速”循环途径主要由小GTP酶Rab4或Rab35调控，可将内吞后的货物从早期内吞体直接运输回细胞膜；“慢速”循环途径则主要由Rab11调控，从近核的早期循环体（early recycling compartment,ERC） 或循环内体 （recycling endosome） 回收货物。然而，目前对于上千种不同的膜蛋白如何正确且高效地循环回细胞膜的途径及相关机制仍然知之甚少，是否存在独立于经典的“快速”和“慢速”途径之外的的循环方式仍待探索。

2024年9月19日，中国科学院遗传与发育生物学研究所的何康敏团队在Nature Cell Biology杂志在线发表了题为Clathrin-associated carriers enable recycling through a kiss-and-run mechanism研究论文。该研究报道了一条新的快速囊泡循环途径，并将其命名为CARP（clathrin-associated fast endosomal recycling pathway） 。

在先前合作发表于Nature杂志的研究工作中 （Nature 2017;552(7685):410-414） ，基于耦合探测原理 （coincidence detection） ，开发了一系列clathrin包被内吞囊泡特异的磷酸肌醇脂质分子探针。其中PI(4,5)P2特异的耦合探测探针，含有可同时弱结合PI(4,5)P2的脂质结合结构域以及弱结合clathrin的蛋白结构域，该探针可被特异招募至同时存在clathrin和PI(4,5)P2的囊泡结构上。在将该探针表达至基因编辑同时荧光标记clathrin及其衔接蛋白AP2的细胞中，利用三色全内反射荧光显微镜 （TIRFM） 对细胞膜进行成像时，该团队发现除了clathrin和AP2同时双阳性的内吞囊泡，还存在一类在细胞膜上短暂停留的clathrin阳性而AP2阴性的囊泡，其能够快速招募PI(4,5)P2特异的耦合探测探针。进一步，通过晶格光片显微镜三维成像和掠入射结构光照明显微镜 （GI-SIM） 的超分辨成像等多种成像方式，证实了clathrin阳性AP2阴性的囊泡是来自于细胞内的囊泡结构，其能够与细胞膜发生短暂 （~5-60 s） 互作并再次回到细胞内，其独特的动力学与经典的内吞囊泡和循环囊泡均不同，该团队将其命名为CARP囊泡。通过基因编辑和单分子成像等方法，该团队发现细胞内的CARP囊泡高度富含另外一种clathrin的衔接分子AP1，并通过胞吐的标志物和光电联合成像等，证明了clathrin/AP1阳性的CARP囊泡以“kiss-and-run”的方式，与细胞膜发生半融合。

为了解析CARP囊泡的组成、来源、功能和调控机制，该团队利用clathrin特异的PI(4,5)P2耦合探测探针，建立了基于TIRFM的活细胞成像筛选和图像分析体系。通过对文献报道的参与囊泡运输的近两百种蛋白的时空动态进行分析，发现了一系列与CARP囊泡相关的蛋白分子，包括Arf1、Rab1、Rab11、exocyst组分、VAMP2等SNARE蛋白、dynamin等，这些蛋白在CARP囊泡与细胞膜融合前、融合中、剪切后等不同阶段招募。通过进一步的实验，证明了这些不同的蛋白在CARP囊泡的生成、运输或融合等不同阶段起着重要的调控作用。

通过活细胞成像和超分辨成像等方法，该团队进一步发现CARP囊泡生成于早期内体。有趣的是，CARP囊泡的组分与VPS35等经典的retromer组分在早期内体上定位于不同的区域，敲除和敲降retromer、retriever等retrieval复合物的核心组分，并不影响CARP囊泡的生成，提示CARP囊泡以独立于retrieval复合物的方式生成于早期内体。在功能上，通过追踪配体激活的GPCR家族β2-肾上腺素能受体以及RTK家族表皮生长因子的内吞以及随后的循环过程，发现这些受体可在内吞两三分钟后即通过CARP途径回到细胞膜。此外，CARP囊泡也能够介导转铁蛋白受体等受体的持续性循环。

综上所述，借助于耦合探测脂质探针、基因编辑、多种成像技术和图像定量分析等，何康敏团队发现的CARP循环途径，其生成方式、与细胞膜的融合方式、功能以及关键调控因子等与经典的循环途径有所不同，可能是一种新的循环方式（下图）。该途径的发现，丰富了对于内吞循环的方式和机制的认知，也揭示了clathrin在介导内吞之外也介导循环的新功能。

中国科学院遗传与发育生物学研究所何康敏研究员为本论文的通讯作者，助理研究员徐家超、博士生梁昱、助理研究员李楠、工程师党颂为该论文的共同第一作者。该项研究工作得到了中科院生物物理所李栋研究员、北京大学刘小云教授、华中科技大学史岸冰教授、北京大学刘轶群博士等的倾力合作与支持。

何康敏课题组致力于利用活细胞单分子荧光成像和开发新的细胞生物学工具，研究囊泡运输和信号脂质的时空动态、调控与疾病，近年来以通讯/共同通讯作者在Nature、Cell、Nature Cell Biology等期刊发表了一系列高水平研究论文，热烈欢迎对科学研究有浓厚兴趣的学生、博士后、助研或副研加盟。

https://www.nature.com/articles/s41556-024-01499-4

制版人：十一

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