Nat Cell Biol | 揭秘细胞对话：Rubicon-WIPI轴调控衰老过程中的外泌体生物合成

撰文 | 咸姐

外泌体是细胞间通讯的重要媒介，它们是直径在30-150纳米之间的小囊泡，能够将蛋白质、脂质和核酸等生物分子从一个细胞传递到另一个细胞，从而调节受体细胞的行为。由于外泌体在多种生理和病理过程中的作用，它们已成为生物医学研究的热点。有研究发现，随着年龄的增长，循环外泌体的数量和组成会发生变化，这些变化可能对衰老过程有重要影响。外泌体中的miRNA等分子随年龄增长而变化，可能影响细胞功能和组织再生能力【1】。然而，外泌体在衰老过程中如何变化，以及这些变化背后的分子机制，目前尚不完全清楚。

外泌体的形成是一个复杂的多步骤过程，涉及内体途径和多囊泡体 （MVBs） 的生物形成。腔内囊泡（ILV） 通过内体膜向内芽生形成MVB，随后MVB与质膜融合，将ILV释放为外泌体【2】。转运必需内体分选复合体（endosomal sorting complex required for transport,ESCRT） 在细胞内负责将膜蛋白和某些货物分子分选到MVB中，进而参与调控这些货物分子的降解或作为外泌体释放到细胞外。研究表明，ESCRT及其相关蛋白可被招募到内体的特定位点来介导ILV的形成【3】，但外泌体生物合成过程中这种招募的详细机制在很大程度上仍然是难以捉摸的。

自噬是一种细胞内部物质降解和循环的过程，对于维持细胞稳态至关重要。在自噬过程中，称为自噬体的双膜细胞器将细胞质成分隔离并与溶酶体融合以降解其内容物。这一过程由一组自噬相关 （ATG） 基因协调，并受到Run结构域与Beclin-1相互作用的富含半胱氨酸结构域蛋白 （Rubicon，Run domain beclin-1-interacting and cysteine-rich domain-containing protein） 的负调控【4】。尽管有研究表明，外泌体的形成与自噬过程密切相关，但具体机制尚未完全明确，确定外泌体的生物合成是否需要整个自噬机制或一些特定的自噬相关因子仍然是一个复杂的问题。

近日，来自日本大阪大学的Tamotsu Yoshimori团队在Nature Cell Biology上在线发表题为The Rubicon–WIPI axis regulates exosome biogenesis during ageing的文章，对自噬相关因子进行了全面的RNA干扰筛选，发现自噬负调节因子Rubicon对外泌体释放至关重要，可以以一种与自噬无关的方式积极调节外泌体的生物合成。证实Rubicon介导了WD重复结构域磷酸肌苷相互作用蛋白2 （WIPI2） 的内体募集，后者可以与MVB形成所需的ESCRT相互作用。同时还发现Rubicon对于与细胞衰老和衰老相关途径相关的miRNA的年龄依赖性外泌体分泌至关重要。

为了确定外泌体释放是需要整个自噬途径还是仅需要特定的自噬因子，本文研究人员首先对自噬相关因子进行了RNA干扰 （RNAi） 筛选，敲低人间充质干细胞 （hMSC） 中的ATG基因和RUBCN，并从培养基中分离外泌体进行western blot检测，结果表明外泌体分泌不需要整个自噬途径，而只需要某些自噬因子。更重要的是，研究人员发现Rubicon定位于CD63+内体，内体PI3P可以以Rubicon依赖的方式在MVB的形成中发挥作用，Rubicon的表达水平是外泌体分泌的决定因素，而且Rubicon对外泌体分泌的调节不依赖于自噬，而是一种先前未知的途径。

为了研究Rubicon如何调节外泌体分泌，研究人员随后探索了其在外泌体生物合成过程中的相互作用蛋白，结果发现WIPI2可以与Rubicon相互作用，促进外泌体分泌。WIPI2是WIPI家族蛋白的成员，WIPI家族被归类为一种β-螺旋桨结构，能够结合多磷酸肌醇 （PROPPIN） ，因此作为结合PI3P的效应蛋白，对自噬体的形成至关重要，但其在外泌体分泌中的作用仍然很大程度上未被探索。那么WIPI2是如何与Rubicon协同调节外泌体分泌的呢？研究结果显示，Rubicon通过其富含螺旋-卷曲区域的蛋白质结构域 （HCR） 与WIPI蛋白相互作用，招募特定的WIPI蛋白到内体以促进外泌体分泌，并且只有WIPI蛋白特异性地募集到Rubicon表达的内体中才能促进外泌体的生物合成，在Rubicon不存在的情况下，即使过表达WIPI2也不会使外泌体分泌增加。与此同时，研究结果显示Rubicon-WIPI轴对MVB的形成至关重要。通过互作组分析，研究人员发现WIPI2d能够与ESCRT组分相互作用，这些相互作用的ESCRT蛋白对外泌体的形成至关重要。进一步的实验结果证实，Rubicon促进WIPI2向内体募集，然后WIPI2将ESCRT蛋白募集到内体以形成ILV（图1）。

图1

为了研究Rubicon-WIPI轴在体内的作用，研究人员又评估了Rubicon敲除 （KO） 小鼠的外泌体分泌情况，结果发现Rubicon KO小鼠血清中的小细胞外囊泡的数量明显减少，但大细胞外囊泡数量没有减少，而脂肪组织源性间充质干细胞 （AD-MSC，外泌体的主要来源） 在Rubicon KO小鼠中表现出外泌体产生减少。与此同时，研究人员还发现，Rubicon在小鼠的衰老过程中对外泌体释放的增加是必需的，随着年龄的增长，Rubicon逐渐积累，并促进小鼠的外泌体分泌。进一步地通过小RNA测序发现，Rubicon对于外泌体miRNA谱的年龄依赖性改变是必需的，这些miRNA与衰老相关的信号通路有关。以miR-26a-5p和miR-486a-5p为例，研究证实它们在衰老过程中以Rubicon依赖的方式分泌到血清外泌体中，抑制衰老相关基因的表达，促进细胞衰老。此外，将衰老供体细胞的条件培养基添加到受体细胞中，研究人员证实Rubicon通过外泌体分泌而不是通过自噬途径介导了细胞衰老。

综上所述，本研究揭示了Rubicon-WIPI轴在外泌体生物合成中的关键作用，其可以正调控ESCRT依赖性外泌体分泌，并指出这一轴在衰老过程中对调节外泌体miRNA数量和质量变化的重要性。这些发现不仅增进了人们对外泌体生物合成机制的理解，而且为开发靶向衰老相关疾病的治疗策略提供了新的靶点。

https://doi.org/10.1038/s41556-024-01481-0

制版人：十一

参考文献

1. Takasugi, M. Emerging roles of extracellular vesicles in cellular senescence and aging.Aging Cell 17, e12734 (2018).

2. Théry, C., Zitvogel, L. & Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function.Nat. Rev. Immunol. 2, 569–579 (2002).

3. Raiborg, C. & Stenmark, H. The ESCRT machinery in endosomal sorting of ubiquitylated membrane proteins.Nature458, 445–452 (2009).

4. Matsunaga, K. et al. Two Beclin 1-binding proteins, Atg14L and Rubicon, reciprocally regulate autophagy at different stages.Nat. Cell Biol.11, 385–396 (2009).

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