猫麻疹病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

作者：程松

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摘要：为建立检测猫麻疹病毒（FeMV）敏感、特异且快速的方法，本研究根据FeMV的L基因保守区设计引物，通过反应条件的优化，建立了快速检测FeMV的SYBR Green I 荧光定量RT-PCR 方法。以质粒标准品pMD19t-FeMV-L为模板，结果显示该方法最低检测下线是30拷贝/ μL，是常规RT-PCR 方法的100倍。组内和组间的重复性试验显示该方法组内和组间变异系数均小于1.3%，具有较好的重复性。特异性实验显示，该方法对猫常见传染病如FPV、FHV、FCV均无有效扩增。本研究建立的FeMV SYBR Green I 荧光定量 RT-PCR 方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的特点，可应用于对FeMV的临床检测。

关键词：猫麻疹病毒；SYBR Green I；检测

猫麻疹病毒(Feline Morbillivirus FeMV)，属于副黏病毒科，麻疹病毒属，是该属最新发现的一种病毒。其基因组为单股负链RNA分子，大小约为 16050 个碱基，拥有所有麻疹病毒属中最大的基因组。FeMV编码6个结构蛋白和2个非结构蛋白：核衣壳蛋白（N）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素蛋白（H）和大蛋白（L），以及2个非结构蛋白C和V。麻疹病毒属的其他病毒5’端序列通常仅有40左右的碱基组成，而FeMV则长达400个碱基。

猫麻疹病毒2012年首次在我国香港地区流浪猫中发现，后随着关注度的提高当前已在全世界各地不同饲养环境的猫中发现该病毒。目前对FeMV的检测主要采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法，有根据P/C/V基因的保守区域设计引物，也有根据L基因保守区域设计引物用于快速检测FeMV。因此本研究根据GenBank目前已有的FeMV的36株全长序列，对比后选择相对保守的L基因并设计引物，建立了能够用于检测FeMV的SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法，该方法为监测FeMV的感染和流行提供了有效检测手段。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料

FeMV质粒由金唯智生物科技有限公司合成，质粒提取试剂盒，SYBR Green I荧光定量酶，pMD19-T载体购自宝生物工程（大连）有限公司，DH5α感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司。

1.2 引物设计与合成

根据GenBank中FeMV基因序列信息，利用DNAStart软件的Megalign程序对比序列，根据FeMV L基因的相对保守序列设计一对引物FeMV-qF/qR,用于建立检测FeMV的荧光定量RT-PCR方法。引物均由上海生工生物有限公司合成（表1）。

表1 L基因的扩增引物

1.3 重组质粒标准品的构建

金唯智生物科技有限公司合成的FeMV（JQ411014：10141-10450，310bp），扩增片段克隆至pMD19-T载体上，构建重组质粒pMD19t-FeMV-L，经PCR鉴定后阳性质粒有擎科生物有限公司测序鉴定。通过紫外分光光度计测定其浓度后计算质粒标准品的拷贝数。

1.4 荧光定量PCR反应条件的优化和标准曲线的绘制

按照Talent qPCR PreMix(SYBR Green) 荧光定量检测试剂盒说明书中推荐的体系，进一步对反应体系中的退火温度（50℃、52℃、55℃、58℃和60℃）进行优化。将重组质粒标准品10倍倍比稀释（101-107）后作为模板，利用优化后的反应条件进行荧光定量RT-PCR反应，每个梯度的模板重复3次，根据反应结果绘制溶解曲线图的标准曲线。

1.5 特异性试验

为了评价所建荧光定量PCR方法的特异性，以猫杯状病毒（Feline calicivirus，FCV）、猫疱疹病毒（Feline herpesvirus, FHV）和猫细小病毒（Feline parvovirus，FPV）的cDNA为模板，同时ddH2O为阴性对照，进行检测，评估所建立的FeMV荧光定量RT-PCR方法的特异性。

1.6 敏感性试验

将重组质粒标准品10倍倍比稀释（101-107），即3x107拷贝/ μL-30拷贝/ μL，以稀释后的标准品为模板，分别建立荧光定量RT-PCR方法和普通PCR方法扩增，评估两种方法的敏感性。普通RT-PCR反应程序为：42 ℃ 45 min；94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 20 s，35 个循环；72 ℃ 7 min。

1.7 重复性试验

将101-107 倍稀释后的重组质粒标准品（即3x107拷贝/ μL-30拷贝/ μL）作为模板，采用本实验建立的方法检测，进行组内和组间的重复性试验，每个稀释度的模板重复 3 次。最后根据不同模板浓度下荧光定量 PCR 反应得到的 Ct 值计算组内组间变异系数，以评价该方法的重复性。

1.8 临床样品的检测

在上海市和北京市采集21份猫尿液和19份肾脏样本提取RNA，以建立荧光定量RT-PCR方法和普通PCR方法分别检测FeMV。

2 结果

2.1 重组质粒标准品的制备

将合成在Puc-GW-Amp载体上的目的基因，连接到pMD19t-FeMV-L进行PCR鉴定，结果显示扩增出310bp的目的条带，与预期相符。进一步测序结果显示扩增片段与目的片段一致，表明重组质粒标准品pMD19t-FeMV-L正确构建。测定浓度100ng/μL，根据公式换算成拷贝数3x1010拷贝/ μL。

2.2 荧光定量PCR反应条件的优化和标准曲线的建立

经模板浓度以及退火温度的优化，最终确定20 μL 反应体系：2×SYBR Green Master Mix 10 μL， FeMV-qFp/qRp 各0.4 μL，模板2μL，50×ROX 0.4 μL，超纯水补齐至20 μL。反应条件为：95 ℃ 3min， 然后 95 ℃ 5 s，52℃ 15s，72℃ 31s ,40 个循环。以 10 倍倍比稀释的重组质粒标准品作为模板进行荧光定量RT-PCR 反应，将得到的 Ct 值作为纵坐标，模板起始拷贝数的对数为横坐标绘制标准曲线(图1A)，获得的标准曲线方程为y = -3.1299x + 31.947，相关系数 R2 =0.9949，扩增效率E=108.6%。溶解曲线温度为80.45℃，且为单一峰(图1B)。表明无非特异性扩增和引物二聚体。

图1A.标准曲线

图1B.溶解曲线

2.3 特异性试验

以临床常见的FPV、FHV和FCV的DNA或者cDNA为模板进行荧光定量RT-PCR反应，结果显示，除了FeMV阳性外，其他猫常见病毒均为阴性结果（图2），表明该方法特异性较强。

图2.荧光定量特异性检测结果

2.4 敏感性试验

将重组质粒标准品 10 倍倍比稀释后（3x107拷贝/ μL-30拷贝/ μL）作为模板，经本研究建立的荧光定量 RT-PCR 扩增，结果显示该方法检测下限为30拷贝/μL（图 4A），而常规RT-PCR 的检测下限为 3000 拷贝/μL（图 3B），荧光定量 RT-PCR 方法的敏感性为常规 RT-PCR 的 100 倍，表明本研究建立的方法敏感性较高。

图3A.FeMV SYBR Green I荧光定量 PCR 敏感性试验结果

图 3B RT-PCR的灵敏性试验

注： M:500DL maker;1-7:107-101;8: Negative control

2.5 重复性试验

用稀释倍数为 101~107 的标准品作为模板，进行重复性试验，利用所得 Ct 值计算变异系数，结果显示，组内变异系数为0.16%~0.86%，组间变异系数为 0.13%~1.08%（表 2），均小于 1.5%。表明该方法重复性较好。

表2 荧光定量PCR重复性试验结果

2.6 临床样本检测

经检测，40份临床样本中荧光定量RT-PCR方法和普通PCR方法检测结果均为阴性。

3 讨论

目前FeMV在不同国家和地区的检测中存在检出率差异较大的现象，如FeMV在尿液中的检出率介于2.7%-23%之间，在肾组织中为2.7%-40%，血清检出率约为18.9%-66.7%，该病毒的检出率的高低可能是由于不同的地理环境或者样本个体差异（如未绝育的公猫比母猫有更高的患病风险；流浪猫比家猫患病率更高）造成的。在首次发现猫麻疹病毒的临床样本上，发现猫肾脏上有间质炎性浸润和肾小管变性坏死，因此推测当猫患有FeMV感染时可能伴随肾小管间质性肾炎。

肾小管间质性肾炎(Tubulointerstitial Nephritis ,TIN)是猫慢性肾病(Chronic Kidney Disease ,CKD)中常见的病理变化。随着FeMV在各地被分离，越来越多的人提出FeMV 感染与TIN 或CKD之间的关联，Sieg M等在患有CKD的8只猫中通过尿路或肾脏样本检测到FeMV阳性，而对照组的尿液样本中未检测到；Yilmaz H等在FeMV阳性病例中发现非常明显的肾小管间质性肾炎的病变；Chaiyasak S等提出 FeMV 在可以在各种其他组织被检测，但是主要靶器官是肾脏并伴有病理变化。CKD是由多种因素引起的，致病因素复杂多样，虽然前人的研究表明FeMV与TIN 或CKD之间是存在联系的， 但是具体关联有待进一步深入研究。同时FeMV具有较高的遗传多样性，存在跨物种感染的可能性，FeMV研究的意义可能不仅仅影响猫的健康；另外FeMV是一种较新发现的病毒，目前尚无足够的病例研究或临床数据，因此建立一种快速、灵敏、特异的检测FeMV的方法非常必要。

本研究通过对GenBank中FeMV所有菌株的序列信息进行对比，对其L基因设计引物，在对各反应条件优化后，建立了一种检测FeMV的SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法，该方法特异性强，仅能特异性扩增而对FPV、FHV、FCV均无效扩增，灵敏度高且重复性好，其检测下线可达30拷贝/ μL比普通PCR灵敏100倍。同时本研究建立的SYBR Green I荧光染料法比TaqMan探针法成本低，可以做到低成本且高标准的推广使用。与常规RT-PCR相比具有灵敏度高、特异性强和线性范围宽等特点，因此该方法的建立有助于对FeMV临床感染监测和诊断。

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