【Nature子刊】哈佛大学团队：类器官培养促进小鼠成肌细胞去分化为肌肉再生的干细胞

【导读】针对骨骼肌疾病的实验性细胞疗法收效甚微，主要是因为它们使用定型的肌原祖细胞，而不是真正的肌肉干细胞，即卫星细胞。在这项研究中，团队提出了一种从骨骼肌组织生成体外衍生卫星细胞（idSCs）的方法。

2024年9月11日，哈佛大学干细胞与再生生物学系Lee L. Rubin团队在期刊《Nature Biotechnology》上发表了题为“Organoid culture promotes dedifferentiation of mouse myoblasts into stem cells capable of complete muscle regeneration”的研究论文。研究结果表明，idSCs可能为治疗遗传性肌肉疾病、创伤引起的肌肉损伤和与年龄相关的肌肉无力，提供可扩展的细胞来源。

https://www.nature.com/articles/s41587-024-02344-7

研究介绍

01

卫星细胞，即经典肌肉干细胞，负责出生后肌肉的生长和再生。它们以静止状态存在，位于基底层和肌肉肌膜之间的生态位中。在肌肉再生过程中，这些细胞激活、不对称分裂，以自我更新或形成定型祖细胞的增殖种群，称为成肌细胞。这些成肌细胞分化并融合形成肌管，肌管是骨骼肌的功能成分。没有卫星细胞，骨骼肌再生就完全被消除。在肌肉发育或再生后，一些卫星细胞恢复静止并重新填充生态位，为未来几轮再生做准备。

许多人假设移植的卫星细胞可以治疗肌肉疾病和创伤性肌肉损伤，然而，卫星细胞在骨骼肌中很少见。目前尚不清楚如何在保持其干细胞特性的同时，有效地增加它们在培养物中的数量，特别是保持它们在生态位中重新填充的能力。在常规组织培养条件下，卫星细胞进入细胞周期并成为成肌细胞。然而，卫星细胞和成肌细胞有关键区别。虽然两者都可以产生肌肉纤维，但移植后，卫星细胞在这个过程中的效率要高出1,000 倍。只有卫星细胞才能在生物体的整个生命周期内，重新填充干细胞生态位、自我更新并维持肌肉再生。卫星细胞和成肌细胞之间的这些关键差异，强调了在体外产生治疗相关数量的卫星细胞的必要性。

在三维空间中培养细胞，可以为多个组织重建干细胞生态位条件，使成体干细胞扩增，同时，保持其分化和成熟的能力。团队研究了3D培养对成肌细胞增殖的影响。成肌细胞可以产生骨骼肌类器官（SkMO），包含类似于卫星细胞的细胞。在体外衍生的卫星细胞（idSCs）中，其被称为骨骼肌类器官（SkMO）。在移植到受损或患病的肌肉中后，idSCs的肌肉再生方式类似于卫星细胞。尽管idSCs共享已知调节静止和肌原定型的关键通路，但它们在转录和表观上是不同的，这引发了关于体外和体内细胞身份之间关系的几个有趣问题。

研究进展

02

idSCs恢复与卫星细胞相当的肌肉功能

团队观察到，移植的idSCs和成肌细胞之间的比力产生，存在显著差异。idSC产生了138±20.49kN×m−2，类似于卫星单元产生的温度（178±16.43kN×m−2），而成肌细胞产生的比力读数可以忽略不计（3±0.88kN×m−2）（在评估最大破伤风力和抽搐力时，这些发现得到了进一步的支持）。在研究结束时，对治疗肌肉的组织学评估，强烈支持肌肉力量数据，并通过量化卫星细胞或idSC移植后获得的每部分肌纤维总数（分别为1,535±145根纤维和1,965±313根纤维）。相比之下，假（盐水）和成肌细胞样品在再生后的纤维要少得多（分别为14±8根纤维和84±12根纤维）。这些发现与移植样本中，位于中央的细胞核的百分比，以及TA肌肉重量相关，这是新再生肌肉的标志。照射后的未受损肌肉缺乏中央有核肌纤维，这与正常条件下，卫星细胞周转的低水平一致。idSCs和卫星细胞在再生后，都以相似的程度，重新占据了卫星细胞生态位，进一步支持晚期idSC重新填充卫星细胞生态位的能力。

针对nGFP idSC的验证结果，分别为98.2%±2.2% CD9CD104++−，而反之，则CD9CD104+−群体中含有87.6%±6.6%的nGFP细胞。CD9CD104+−与nGFP排序的idSC相比，存在重新填充卫星细胞生态位的供体细胞，idSC导致相似水平的肌肉形成。和类似的平均比力值（163±22.7kN×m+−2相对于nGFP排序138±20.49kN× m+−2） 、TA肌肉重量和位于中央的细胞核的百分比，与CD9CD104++−移植具有可比性。

idSCs在移植到再生肌肉后，产生功能性肌肉的能力与卫星细胞相似。

人类SkMO中idSC形成的总结

在人SkMO形成后，PAX7细胞的百分比在重复中的变异性降低，占总细胞的5%±1%。虽然成肌细胞中的PAX7细胞主要是MYOD（84%±2%），但在人SkMO中，少数是MYOD（5%±2%）。与这些发现一致，团队观察到，从增殖成肌细胞过渡到人类SkMO时，EdU细胞的百分比总体降低，导致成肌细胞（30%±22%）和人SkMO（0.8% ± 1.7%）之间PAX7EdU细胞的百分比降低。这些发现表明，SkMO的形成，驱动跨物种的成肌细胞去分化到静止状态，其中，Pax7维持而MyoD表达不存在。

idSCs在抗肌萎缩蛋白缺陷小鼠模型中体内移植、重新繁殖和自我更新。

研究结论

03

临床细胞疗法的一个障碍，是大规模生产细胞。团队目前的方法（旋转瓶培养或轨道摇动培养），应该很容易转移到用于中大规模生产同种异体细胞的方法。然而，自体使用团队的细胞，需要较少的扩增/批次，但需要能够在一系列患者中生成细胞。目前，甚至在优化之前，团队就成功地在4个患者成肌细胞样本中，生成了数千个SkMO/批次，其中一些，甚至是高传代的。人类TA肌肉的重量，大约是小鼠TA肌肉的1,000倍。在将10,000个idSCs移植到经过辐照和CTX处理的NSG小鼠后，团队可以再生没有自身卫星细胞的小鼠TA的所有受损肌肉。随着团队的生产方案和培养基的进一步优化，团队将能够从单次肌肉活检中，产生1,000万个人类idSC。这应该足以修复人类TA肌肉。从转化的角度来看，这可能是产生自体细胞，以治疗影响肌肉子集的遗传疾病、创伤引起的肌肉损伤（运动、事故或军事相关）和年龄相关性肌肉无力（肌肉减少症）的患者的可行方法。团队方法的未来迭代，结合基因疗法或CRISPR介导的基因编辑，可以保持肌肉质量，并提供针对各种退行性遗传性肌肉疾病的校正基因。

参考资料：

1.Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. J. Biophys. Biochem Cytol. 9, 493–495 (1961).

2.Sambasivan, R. et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development 138, 3647–3656 (2011).

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