动物行为与光电专题（37）丨浅析Miniscope相关动物实验应用

监测神经细胞活动：

轻型2光子微型显微镜，用于自由活动的小鼠的钙成像，在广泛的行为范围内观察到稳定的高质量成像，可以监测超过1,000个视觉或内嗅皮层细胞的活动，定制设计的z扫描模块可实现跨多个平面的快速成像。不受限制的行为取决于微型显微镜的重量和电缆的灵活性。

攀爬实验：

首先，对3D探索任务中的MEC活动进行成像，其中训练小鼠在梯子上垂直攀爬到长方体平台（7×7-cm2底座，22厘米高）的顶部，然后跳下来，然后开始另一次攀爬（每天攀登10次或以上的标准）。使用和不使用微型显微镜和电缆的实验顺序是随机的。显微镜对动物的攀爬速度或准备跳跃的时间没有可检测到的影响。尽管快速和突然的运动，成像数据的质量仍然保持。刚性和非刚性运动仍然较低。在跳跃过程中，刚性运动稍高，并且由于电缆的阻力而向一个方向偏置；然而，运动校正后，整个实验期间任何时间观察到的最大残余漂移均小于0.4μm。这比在开放场地中MEC成像期间观察到的要少，这表明即使是最快和最突然的运动也可以被纠正。MINI2P的稳定性能够识别在爬升、平台顶部或跳跃期间优先活跃的MEC细胞。第一部分：梯子攀爬和跳跃期间MEC中的钙成像（三个攀爬/跳跃试验）。第二部分。声音引起的突然逃跑（威胁）期间VC的钙成像。显示了三个威胁/逃脱试验。两个视频均采用5帧运行平均值进行可视化。

光纤记录与钙成像技术交流群

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爬梯任务沿MEC植入1.6毫米棱镜，并使用MINI2P-L微型显微镜记录。当鼠在一个40厘米宽的方形竞技场中爬上并跳下一个高平台时，钙活动成像，该竞技场有黑色橡胶地板和50厘米高的黑色丙烯酸墙壁。3D打印白色聚乳酸（PLA）平台（22cm高，7×7cm2宽），其垂直表面之一（22cm×7cm）填充有6×6mm2的方孔，水平和垂直方向由4毫米（共22×7孔）。这些洞充当了动物攀爬的梯子。平台内部安装了一个重钢块（1公斤）以保持其稳定。单色相机安装在盒子外部，并配有3.5毫米镜头通过方形场地上的一个孔进行横向拍摄墙。显微镜重量习惯后，每天进行测定，持续6天，从第0天开始进行尚未安装MINI2P微型显微镜的试验。每个实验都以3分钟的适应期开始，在此期间，小鼠自由探索空旷的场地（没有平台）。然后将平台放置在竞技场内，并在平台顶部放置非常美味的奖励（一块甜奶油）。平台位于摄像机对面的墙壁附近，梯子表面面向摄像机。动物被训练垂直爬到平台顶部以获得奖励，然后从平台上跳下来开始另一次攀爬。下一次奖励是在动物跳下平台后立即手动给予的。随后，一个新的奖励被放置在平台之上。30分钟后，或者动物没有爬梯子超过5分钟，实验停止。

实验的攀爬和跳跃阶段是通过目视检查视频记录来确定的。当所有4英尺离开地面时，攀爬阶段开始，攀爬结束被定义为所有4英尺首先到达平台顶部的时间。跳跃阶段从动物的后脚抓住平台边缘的准备阶段开始，然后是下落间隔，从所有4只脚离开平台开始，到后脚接触地板时结束。准备跳跃的时间定义为准备期开始和跌倒开始之间的时间。着陆/跳跃间隔定义为最后一次跳跃结束和下一次爬升开始之间的时间。

逃跑实验：

使用直径90厘米的高架圆形竞技场，并在靠近外围放置了地上避难所。经过最初的探索阶段后，类似白噪声的响亮声音刺激（80-83dB）引发了动物快速而有力的逃跑。使用和不使用微型显微镜对小鼠进行了测试（9次和10次声音试验，间隔3天）。在这两种情况下，声音刺激首先引起头部突然旋转，明显超过探索期间记录的角速度。旋转后快速逃往避难所位置。携带MINI2P显微镜对行为没有可检测到的影响（角速度、逃逸误差和线速度）。与非逃逸期相比，成像保持稳定，最大残余漂移小于0.4μm。成像的稳定性能够识别出22个在逃逸过程中选择性活跃的VC细胞。

逃脱任务在铺有黑色橡胶地板的高架圆形竞技场（直径90厘米）中进行。圆形黑色亚克力墙（直径110厘米，高50厘米）放置在竞技场周围但不与竞技场接触，以将其与外部视觉线索隔离。竞技场包含一个放置在竞技场边缘的地上避难所（红色半透明亚克力盒子：17x11x15cm3），有一个7厘米宽的入口面向竞技场中心。听觉刺激（听觉威胁）是一种类似白噪声的声音，是通过从老鼠感觉不到气流的位置在墙壁上边缘后面释放压缩空气而产生的。在竞技场中心测得的声压约为81分贝（80至83分贝）。手动触发声音刺激，并使用通过BNC电缆连接到vDAQ卡的压力传感器记录刺激的持续时间。使用VC上带有5毫米直径颅窗的小鼠进行两次实验，每次30分钟，并用MINI2P-L显微镜记录。显微镜重量习惯后，用安装的MINI2P显微镜进行第一次实验，记录VC的神经活动（15Hz，单平面）。3天后，第二次实验在没有MINI2P显微镜的情况下进行。每次实验之前，动物笼子里的垫料都放在庇护所内。经过5分钟的适应期（在此期间，小鼠必须至少进入避难所一次），当动物探索竞技场时，会发出声音刺激。当动物开始逃跑时，刺激终止（所有试验中为0.6秒至1.7秒）。在每个实验日，以至少30秒的试验间隔提供多次刺激（使用MINI2P时为9次，不使用MINI2P时为10次）。

旷场实验：

在任何实验之前，所有小鼠都习惯于处理和行为任务，并且每天在最后准备期间将动物放置在记录室中，以便熟悉周围环境。该任务是在一间暗室中实施的，唯一的光源是天花板上的暖光LED灯条，以促进探索。一个实验由持续30分钟或40分钟的单个记录组成、4中VC成像的3个FOV中的每一个），或1小时；当动物自由探索80×80cm2方形黑盒或55×55cm2方形黑盒时，记录神经活动。将一张白色层压A4纸固定在盒子的一面，作为偏光提示。使用近红外相机从上方记录动物的位置。动物行为跟踪通过安装在80×80cm2（或55×55cm2）黑色地板方盒顶部的单色相机监控动物的行为。带有16毫米镜头的盒子。环境和地板由安装在盒子周围不同角度和规则位置的LED灯均匀照明。875nm短通滤光片安装在相机前面，以滤除从微型显微镜泄漏的920nm激光。跟踪视频是使用相机公司的软件或自定义LabView程序以外部模式录制的。在2P成像的每一帧开始时，vDAQ卡会生成一个TTL脉冲（0-5V），这会触发动物跟踪摄像机的一帧记录。这样，动物跟踪视频采集始终与2P帧采集同步。

大小鼠旷场实验箱，型号：XR-XZ301

动物瘙痒行为：

由于痒觉出现过程非常快、神经元发放也很快，而且不同比例的神经元在痒觉感知的不同阶段出现，要求成像设备不仅需要快速记录单个神经元，具备高空间分辨率以区分两类神经元。

动物觅食行为：

头戴式微型显微镜小鼠自由觅食行为，在80厘米宽的方形开放场地盒子内，在30分钟内奔跑寻找分散的食物碎片。将动物放入盒子中并允许其自由移动，同时实验者定期向环境中扔饼干屑。可选用向日葵种子觅食测试，以研究努力和先前的行为如何影响实验室小鼠的决策。葵花子是老鼠最喜欢的天然食物，鼠费力剥去硬壳来获取种子。去皮和未去皮的葵花籽被放置在 Y 形迷宫的不同末端。鼠可以自由探索迷宫并做出觅食决定。幼稚的老鼠更有可能选择需要低努力的去皮种子，而不是需要高努力的未剥皮种子。

文献引用：

• Zong W, Obenhaus HA, Skytøen ER, Eneqvist H, de Jong NL, Vale R, Jorge MR, Moser MB, Moser EI. Large-scale two-photon calcium imaging in freely moving mice. Cell. 2022 Mar 31;185(7):1240-1256.e30.

• Dylda E, Wang KH. Prior actions influence cost-benefit-related decision-making during mouse foraging behaviours. Eur J Neurosci. 2022 Jul;56(2):3861-3874.

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