Cell：张锋团队揭示首个真核基因编辑系统Fanzor的结构多样性和DNA切割机制

编辑 | 王多鱼

排版 | 水成文

2023年6月28日，张锋团队（Makoto Saito和徐沛雨为论文共同第一作者）在Nature期刊发表论文【1】，在真核生物中发现了第一个RNA引导的DNA切割酶——Fanzor，更重要的是，这种新型CRISPR样系统，在真核生物中广泛存在，且具有独特的基因编辑潜力，可以在重编程后实现对人类基因组的编辑。相比CRISPR-Cas系统，Fanzor系统非常紧凑，更容易递送到细胞和组织中。而且，Fanzor系统没有旁系切割活性，可实现更精准的基因组编辑。

2024年8月28日，张锋团队（徐沛雨和Makoto Saito为论文共同第一作者）在Cell期刊发表了题为：Structural Insights into the Diversity and DNA Cleavage Mechanism of Fanzor 的研究论文【2】。该研究展示了Fanzor蛋白在不同生物中所表现出的分子多样性，并深入解析了其通过RNA引导的DNA切割机制，为进一步的基因工程改造和开发奠定了基础。

2021年9月，张锋团队在Science期刊发表论文【3】，发现了一类广泛的转座子编码的RNA引导核酸酶，并将其命名为OMEGA系统（包括IscB、IsrB、Tnp8），它是CRISPR-Cas系统的祖先。

而Fanzor是一种由转座子编码的真核TnpB-IS200/IS605样蛋白，来自真核生物的Fanzor蛋白与来自原核生物的Tnp8具有远程同源性。对Fanzor蛋白的生化表征表明，Fanzor是一类DNA切割内切酶，使用ωRNA来靶向基因组中的特定位点。这是首次在包括动物在内的真核生物中发现这种机制。

张锋团队发现，Fanzor系统可以在人类细胞的目标基因组位点上产生DNA插入和缺失，但其最初在剪切DNA方面的效率低于CRISPR-Cas系统，通过系统工程改造，张锋团队在Fanzor蛋白中引入了一系列突变，可使其活性提高10倍。此外，张锋团队还发现，与一些CRISPR系统和OMEGA系统中的TnpB不同，真菌来源的Fanzor蛋白没有表现出旁系切隔活性（Collateral Activity），也就是说，Fanzor不会在RNA引导下切割目标位点附近的DNA，这意味着，Fanzor可能实现比CRISPR-Cas系统更精准的基因组编辑。

在这项发表于Cell期刊的最新研究中，张锋团队通过冷冻电镜解析了来自不同物种的Fanzor蛋白以及不同构象下的13个结构，包括来自藻类Guillardia theta的GtFz1、真菌Spizellomyces punctatus的SpuFz1和寄生真菌Parasitella parasitica的PpFz1。

这些结构揭示了Fanzor蛋白在RNA结合、DNA识别和切割中的独特性。例如，该研究发现，尽管这些蛋白在RNA结合界面上表现出保守性，但在DNA靶向临近基序（Target-adjacent Motif，TAM）的识别和负责切割的催化位点上存在差异，尤其是GtFz1的催化三联体中出现了非典型的N残基，这一变化增强了其体外DNA切割活性。此外，PpFz1中的一个独特结构域被发现能够与一种称为亲环蛋白（Cyclophilin）的蛋白质结合，提示其可能在寄主生物的生理功能中扮演重要角色。这一发现揭示了Fanzor蛋白在基因转移和寄生关系中的潜在功能。

此外，该研究通过解析不同DNA结合构象的结构，揭示了Fanzor如何调控自身以激活DNA切割活性。在GtFz1中，未结合DNA的状态以及两个结合了不同形式DNA的结构展示了REC结构域在R-loop形成和稳定中的关键构象变化。而在SpuFz1和PpFz1中，研究解析了具有不同数量Guide/DNA碱基配对的结构，揭示了RuvC结构域中的一个环状结构（通常被称为“Lid”）对蛋白激活的关键调控作用。该研究还发现，这个Lid能够随着Guide/DNA配对碱基的数量发生构象变化，从而调控蛋白的激活。通过对同源蛋白家族的模型分析，研究团队还发现这个Lid区域在所有Cas12、TnpB和Fanzor家族蛋白中都可能存在构象适应性，暗示了一种广泛存在的RNA引导核酸内切酶活性的激活机制。

总的来说，该研究通过来自不同物种以及不同DNA结合构象的Fanzor蛋白结构分析，揭示了该家族蛋白的分子多样性，并揭示了Fanzor蛋白的激活机制。该研究不仅深化了领域对Fanzor家族分子机制的理解，也为未来基因编辑工具的设计提供了新的思路。

论文链接：

1. https://www.nature.com/articles/s41586-023-06356-2

2. https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(24)00844-4

3. https://www.science.org/doi/10.1126/science.abj6856