动物模型与评估丨啮齿动物机械痛阈检测

SNI小鼠模型制备：

将小鼠称重，采用异氟院进行呼吸麻醉，俯卧固定于操作台上。左后肢剃除皮毛，充分暴露切口，碘伏消毒2遍，酒精脱碘。在股骨大转子与腔骨头连线中点的上方做1cm开口，钝性分离皮下组织和肌肉，暴露坐骨神经主干及其分支。用非吸收性6-0缝线紧紧结扎并左右切断2mm腓总神经和腓肠神经，保留胫神经，逐层缝合伤口后肌肉注射8万单位青霉素以防伤口感染，并用碘伏消毒。神经病理性疼痛模型组、１00Hz电针组均进行坐骨神经分支选择性损伤（Spared Nerve Injuiy，SNI）造模，假手术组小鼠暴露神经但不进行结扎和切断。

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实验动物分组及处理：

建模前5d，每天检测小鼠的50%机械缩足反应阈值(MWT)，确定小鼠的基础阈值，剔除痛阈异常小鼠。按随机数字法，将建模组小鼠分为五组，分别是建模无治疗组(SNI组)、建模5d腹腔注射葛根素组(SNI-PA组)、建模5d鞘内注射葛根素组(SNI-PI组)、建模前5d予以鞘内置管并于建模5d经导管注射葛根素组(SNI-PC组)、建模5d鞘内注射生理盐水组(SNI-NS组)。对照组小鼠随机分为三组，即正常对照组(CON组)、正常鼠鞘内注射生理盐水组(CON-NS组)、正常鼠鞘内注射葛根素组(CON-PI组)。于SNI模型建立5d，确认痛阈明显降低后，当天即予以药物处理，后于每天9:00至12:00给药一次，持续给药至建模15d，每次予鞘内注射5μl葛根素，即葛根素浓度为4μg/μl;腹腔注射0．5ml葛根素，即葛根素的治疗剂量为100mg/kg。生理盐水组与SNI-PI组注射时间、剂量相同。排除小鼠SNI建模失败、建模后小鼠出现自噬、伤口感染或左下肢完全瘫痪等影响痛阈测量、置管后利多卡因实验阴性(置管失败)、鞘内注射或置管后偏瘫甚至死亡等因素，最终保持各组小鼠的数量均为5只。

检测指标：

(1)行为学观察：给药后2d每天观察小鼠因建模所致的左足五趾收拢外翻畸形有无变化。

(2)机械痛阈检测：

采用经典von Frey丝测痛法检测小鼠左后足机械缩足阈（Paw Withdrawal Thresholds，PWTs），检测时间为9：00am－5：00pm。实验环境：保持室内温度23－25℃，湿度40－60％，噪音小于40分贝。将每只小鼠单独置于金属丝网格平台架上的单个不透明有机玻璃盒罩中，适应30min左右，直到小鼠安静停止探索、理毛等行为。给药后测量CON组、SNI组、SNI-NS组、SNI-PC组、SNI-PI组、SNI-PA组小鼠左足机械痛阈，计算50%MWT。每次测定选择当天9:00至12:00，室温23℃，在安静的环境下，将小鼠置于底为3mm×3mm的金属丝网的透明有机玻璃箱中，适应15min，从中等力度的纤毛(0.16g)开始测试，根据小鼠是否出现抬足或舔足表现，按照“up and down”方法，分别以上一级力度或下一级力度的von-Frey纤毛垂直刺激小鼠左足底皮肤，避开足垫，所用纤毛折力分别为0．008、0．02、0．04、0．07、0．16、0．6、1．0、1.4、2．0g。从测痛笔最小值0．02g开始，刺激克数按序逐渐增大进行测量。对小鼠进行足底刺激时，保持前方笔丝弯曲2s左右，当小鼠突然出现缩爪、抬爪或舔爪等阳性反应时，此时的机械敏感性伤害性反应表示为以g为单位的PWTs。若小鼠抬足，出现缩回反射则记为√，否则即为×。每种力度测量5次，刺激力量由小到大，直至测量的5次中都出现缩回反射，此时的刺激力量记为阳性反应机械力值。记录力度值及相应数据后，进行统计分析，计算出小鼠机械痛的阈值。5次刺激中出现3次阳性反应，则定义为当前的机械缩足阈值。每次测量间隔1min以上。每次刺激间隔至少30s，最大折力为2.0g，超过此值时记为2.0g，根据刺激的纤毛力度及小鼠的缩足反射推算50%MWT，所有测量均由同一人完成。每次测量前后均要清理金属丝网格平台架和不透明有机玻璃盒罩，用75％酒精消毒。检测时间点为造模之前，造模后7d、14d。在测量基础痛阈前要进行三天适应性机械痛阈检测，以减少环境的影响和让小鼠学会抬足。

(3)腰段患侧脊髓背角促炎症因子检测:分别提取CON组、建模7dSNI组、给药7dSNI-NS组、SNI-PC组、SNI-PI组、CON-NS组、CON-PI组小鼠患侧脊髓背角，通过RT-qPCR检测促炎症因子IL-1β。

所有SNI建模组小鼠于建模3d即可见明显的左足畸形，表现为五趾并拢屈曲、轻度外翻，行走时以右足为主，左足不敢着地或轻靠在地，间或出现缩足或舔足行为。与CON组小鼠相比，SNI建模组小鼠行为差别明显。建模组中SNI-PC组、SNI-PI组小鼠建模后左足不敢落地或以右足为主行走且多次舔足现象于给药后明显好转，左足可以着地行走，且舔足次数减少，但五趾并拢内收，轻度外翻屈曲现象无明显改善。SNI-PA组、SNI-NS组与SNI组相比无明显改善。

Fig1小鼠疼痛阈值测定

A:机械痛阈值变化;B:热痛阈值变化。aP＜0.05，bP＜0.01vsCTＲ组。CTR组:对照组;SNI组:选择性坐骨神经损伤组

文献引用：

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6.外侧缰核在疼痛与负性情绪中的作用及其机制[J]. 杨新江;李海涛;王菲;解柔刚;罗层;杨清湖.神经解剖学杂志,2023(03)

7.杨新江,李嘉琳,丁慧,等.慢性束缚应激模型诱致抑郁和痛敏的行为学研究[J].空军军医大学学报,2023,44(11):1059-1063.

8.杜金乐,王振玉,康鑫,等.疼痛伴发焦虑抑郁情绪变化与小鼠内侧前额叶和前扣带回皮质神经元激活的时程性关系研究[J].空军军医大学学报,2023,44(11):1034-1040.

9.Representation and control of pain and itch by distinct prefrontal neural ensembles.[J]. Pan Qian;Guo SuShan;Chen Ming;Su XinYu;Gao ZiLong;Wang Qi;Xu TianLe;Liu MingGang;Hu Ji.Neuron,2023

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