概述PCSK9 小分子抑制剂

之前分享了关于PCSK9研发进展汇总，PCSK9 抑制剂：下一代脂质控制靶点的药物汇总。

这里分享PCSK9小分子抑制剂开发现状:

1. 小分子抑制剂

PCSK9 抑制剂是降低 LDL-C 水平的高效疗法。目前靶向PCSK9的单抗类药物和siRNA药物已经获批，然而，常规护理的临床实施进展并不像希望的那样迅速或顺利。一个主要障碍是治疗方法的可及性有限，这主要是由于担心医疗保健提供者的费用过高。此外，口服药物具有给药更简单的优点，并避免了与注射相关的潜在风险和不适。因此，在过去的十年中，人们开发了多种小分子化合物来抑制PCSK9的功能。

1.1 天然化合物抑制剂

有趣的是，一些天然产物，如小檗碱、赤芍苷D、姜黄素、五味子C、虎杖甙、白花椒苷A、柚皮苷等，已被报道可直接或间接抑制PCSK9的功能。例如，erybraedin D 通过激活腺苷 5'-单磷酸 (AMP) 激活的蛋白激酶 (AMPK) 来抑制 PCSK9 蛋白合成 (IC50 = 7.8 μM)。

1.2 人工合成小分子抑制剂

例如，研究发现了一种二氟-2,3'-二吲哚基甲烷（DFDIM）骨架小分子抑制剂，可以降低细胞系模型中PCSK9的表达，IC50≈200 nM。开发出一种有效的小分子 PCSK9 抑制剂7030B-C5(IC50 = 1.61 μM)，可显着降低血浆胆固醇和 TG 水平，并延缓体内动脉粥样硬化进展。还有通过筛选来自多样性导向合成的小分子库中上调脂质代谢基因 TRIB1 表达的化合物，鉴定了一系列新型 PCSK9 拮抗剂，例如BRD8518（[EC50] = 0.23 μM）。

此外，基于共晶结构的药物发现表明，C9（ [Ki] = 59 nM）结合在位于 PCSK9 催化结构域和 C 末端结构域之间的变构袋中。

鉴定出一种化合物3f，它可以在体外以纳摩尔水平破坏 PCSK9-LDLR 相互作用 (IC50 = 537 nM)，并以亚微摩尔水平恢复肝细胞中的 LDL 摄取。

辉瑞公司开发的化合物PF-06446846(IC50 = 2.2 μM) 通过抑制 pro-PCSK9 蛋白的翻译机制刺激肝癌细胞摄取 LDL-C。进行结构修饰以改善药代动力学特性和效力，所得化合物PF-06815345(IC50 = 0.3 μM) 已进入临床试验 (NCT02654899)，但已被辉瑞公司停止。

值得注意的是，CVI Pharmaceuticals 在 1b 期研究（CTR20160744）中公开了一种化合物CVI-LM001，可将 LDL-C 水平降低 26.3%，TC 降低 20.1%，ApoB 水平降低 17.4%。目前，CVI Pharmaceuticals正在招募2期临床试验参与者，以进一步评估CVI-LM001治疗高胆固醇血症的有效性（NCT04438096）。

此外，Wang 等报道了一种化合物DC371739，它可以在动物模型中抑制PCSK9 mRNA表达并降低血浆总胆固醇（TC）、LDL-C和TG水平，并且DC371739在1期试验（NCT04927221）中显示出初步阳性结果。

1.3 拟肽类抑制剂

此外，近年来还开发了几种具有高亲和力的PCSK9靶向肽模拟物。例如，Stucchi 等合成了 N-甲基四咪唑衍生物MeIm，其抑制 PCSK9 与 LDLR 的结合（IC50 = 11.2 μM）并增加细胞中 LDL 的摄取（EC50 = 6.04 μM）。使用探索关键方向（EKO）方法，设计并合成了一种拟肽LDLL-1dinr，它与 PCSK9 结合（Kd = 24.8 μM），并有效增强 LDLR 水平和 LDL 摄取，且无细胞毒性，最高可达 100 μM。

诺华发现了一种有效的环肽 13PCSK9i（[Kd] ≈300 pM，EC50 = 0.170 μM，最大吸收 [Amax] = 77% [LDL 摄取]），它以低纳摩尔亲和力抑制 PCSK9雄性 C57BL/6 小鼠的血浆 TC 水平降低了 43%，肝脏 LDLR 水平提高了 90%。

Merck 开发了几种低分子量环状四聚体，例如环状四聚体C12，它在 PCSK9 时间分辨荧光共振能量转移 (FRET) 测定中抑制 PCSK9，IC50 值为152 pM。Tombling 等设计了 PCSK9 靶向肽模拟物tetra-P9-38的四价树枝状聚合物（IC50 =180 pM），它完全恢复了 PCSK9 处理的 HepG2 细胞中的 LDLR 水平和 LDL 摄取。最近，默克公司的MK-0616（Ki = 2.39 pM）和诺和诺德公司的NN-6434（结构未公开）这两种肽PCSK9抑制剂已进入2期临床试验，以评估高胆固醇血症的有效性治疗（NCT05261126、NCT04992065）。

2. 新兴PCSK9抑制剂的开发策略

2.1 基于表型筛选和基于结构的药物设计

已使用多种策略来开发 PCSK9 抑制剂。其中，表型筛选和基于结构的药物设计是 PCSK9 抑制剂发现的最常见策略。例如，为了寻找抑制 PCSK9 功能的小分子，在过表达重组 ProLabel 标记的 PCSK9 的中国仓鼠卵巢 (CHO)-K1 细胞系中进行了基于表型的高通量筛选。令人惊讶的是，R-IMPP (PF-00932239)作为抗 PCSK9 的先导化合物从 255 万种化合物中分离出来（图 1a-(a)）。为了改善 R-IMPP 的药代动力学特性，对其进行了结构修饰，并发现了口服生物可利用的 PF-06446846（图 1a-(a)）。为了获得更好的安全性，随后通过不同的修改开发了 PF-06815345 和 PF-06649492（图 1a-(a)）。PF-06815345最终被辉瑞选定为临床试验候选药物（NCT02654899），但临床试验因不明原因终止。

此外，一种有前景的 PCSK9 抑制剂CVI-LM001（2 期，NCT04438096）是由天然化合物紫堇碱改造而成（图 1a-(b)）。CVI-LM001是通过抑制PCSK9基因表达的机制通过表型筛选鉴定出来的。

另一种候选药物DC371739（I期，NCT04927221）衍生自小檗碱。通过半定量 RT-PCR 测定，已从约 700 种中草药中鉴定出小檗碱，以寻找增加 LDLR mRNA 表达的化合物。随后通过筛选假天然产物和构效关系（SAR）研究开发了DC371739（图1a-（c））。

图1.开发新兴 PCSK9 抑制剂的策略。

a. 四种代表性 PCSK9 抑制剂的开发策略：PF-06815345 (a)、CVI-LM001 (b)、DC371739 (c) 和羧酸 9 (d)。

2.2 基于结构的药物设计

基于结构的药物设计是开发 PCSK9 抑制剂的有效方法。通过亲和选择/质谱 (AS/MS) 和细胞热位移测定 (CETSA) 从 200,000 种化合物中鉴定出 PCSK9 结合剂C4（图 1a-（d））。幸运的是，获得了C4与PCSK9结合的X射线共晶结构（图 1b）。然后，通过基于结构的药物设计策略提高了C4的活性（图1a-（d），5b）。共晶结构表明，C4 的 R 对映体而非 S 对映体与 PCSK9 强烈相互作用。在化合物C5上添加羧酸基团导致PCSK9的R476之间形成盐桥，从而增加了C5和PCSK9之间的结合能力。随后，当将氟基团添加到化合物C6的酸部分时，在R476之间产生氢键，这进一步提高了PCSK9的稳定性。最后，通过添加四氢吡喃部分开发了C9，由于四氢吡喃氧和PCSK9的R357之间形成氢键，显着提高了PCSK9的稳定性。

图1.开发新兴 PCSK9 抑制剂的策略。

b.带有小分子抑制剂的PCSK9的晶体结构。晶体结构改编自（PDB ID：6U3X、6U2N、6U2P、6U38）

2.3 基于肽的修饰策略

值得注意的是，基于肽的修饰是 PCSK9 抑制剂开发的另一个新兴策略。由于PCSK9/EGF-A和PCSK9/LDLR肽复合物的共晶结构已经获得（图 1c-(a)），因此各种有效的拟肽PCSK9抑制剂被开发出来。最近，默克开发了一种口服生物可利用的基于肽的 PCSK9 抑制剂 MK-0616，该抑制剂衍生自 mRNA 展示选择（图 1 c-(b)、(c)）。基于共晶结构，MK-0616或其类似物可以与PCSK9蛋白的Thr377、Phe379和Ser381形成氢键（图 1c-(c)））。MK-0616 在人血浆中抑制 PCSK9，IC50 (2.5 ± 0.1 nM)，并在临床前研究中表现出足够的安全性和口服生物利用度。在健康成人的 1 期临床试验中，MK-0616 使 LDL-C 的几何平均值最多降低 61%（95% CI，43%-85%）。MK-0616 总体耐受性良好，研究期间未报告死亡或严重不良事件 (AE)。在成人高胆固醇血症的 2 期研究中，所有剂量的 MK-0616 均显示 LDL-C 相对于基线 (NCT05261126) 的变化具有统计学显着性 (P < 0.001) 差异。

图1.开发新兴 PCSK9 抑制剂的策略。

c. PCSK9与EGF-A（粉色）、LDLR肽（绿色）（a）或PCSK9与MK-0616类似物（b）的共晶结构，以及从mRNA显示开发大环PCSK9抑制剂的策略（c）。晶体结构改编自 https://www.rcsb.org/（PDB ID：3BPS、4NE9、6XIE）。

2.4 基于肽噬菌体库筛选的策略

此外，使用随机线性肽噬菌体库筛选来鉴定与PCSK9的EGF-A结合位点结合的Pep2-8（图1d-(a)）。有趣的是，通过使用钉状肽段和结构诱导探针技术对Pep2-8进行修饰，产生了一些有效的PCSK9拮抗剂（图1d）。在 Pep2-8 的 C 端添加 6 个赖氨酸残基显著提高了结合亲和力，因为 PCSK9 表面上带负电荷的氨基酸残基（Glu159、Asp343、Glu366 和 Asp367）靠近 Pep2-8 结合位点。通过在 Glu7 和 Asp11 残基处添加内酰胺桥或在 Pep2-8 的 N 端引入单突变，进一步提高了结合亲和力（图 1d-(a)）。值得注意的是，据报道，PCSK9 上 EGF-A 结合位点附近的隐秘凹槽是一个有吸引力的靶位点（图 1d-(b)）。因此，发现了凹槽结合肽段同时被发现。令人惊讶的是，通过侵入有机部分或将两个肽连接成融合体来连接占据凹槽和EGF-A结合位点的肽是开发PCSK9抑制剂的有力策略（图1d-（ b)、(c))。尽管出现了多种发现 PCSK9 抑制剂的策略，但当前基于肽的方法开发有效的口服抗 PCSK9 药物仍然存在挑战。

图1.开发新兴 PCSK9 抑制剂的策略。

d. Pep2-8 (a) 和凹槽结合 Pep1 (b) 与 PCSK9 复合物的晶体结构以及开发所示 PCSK9 抑制剂的策略。