单体1区-中国中医科学院: 甘草酸通过AKR7A2抑制氧化应激改善肝纤维化

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导读

肝纤维化是一种可逆的病理现象，是由持续性肝损伤后肝脏结缔组织的异常增殖引起的自我修复。在这些组织中，肝星状细胞（HSC）的活化状态至关重要。甘草酸（GA）药物已被证明具有优异的抗纤维化作用，但其作用靶点尚不清楚。本研究旨在探讨GA及其靶点在活化HSC中的抗肝纤维化作用，用20%四氯化碳（CCl4）制备肝纤维化小鼠模型，并连续给予GA 4周；随后，测定丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、Ⅲ型前胶原肽（P III P）、层粘连蛋白（LN）、透明质酸（HA）和Ⅳ型胶原（ColⅣ）的水平；对肝组织进行苏木精和伊红（HE）、Masson和Sirius红染色以及蛋白质组测序分析。基于LX-2细胞，我们使用基于活性的蛋白质谱（ABPP）来研究GA的潜在靶点，并通过细胞热转移分析（CETSA）、免疫荧光共定位、分子对接、小干扰RNA（siRNA）和蛋白质印迹（WB）分析进一步验证。在体内，GA显著降低了血清ALT、AST、HA、P III P、Col IV和LN水平。HE、Masson和Sirius红染色显示，GA显著改善了CCl4处理小鼠的肝脏炎症反应和胶原沉积。蛋白质组测序结果表明，GA主要调节参与谷胱甘肽代谢的谷胱甘肽S-转移酶家族成员。在体外，GA显著抑制LX-2细胞增殖，减少活性氧的积累。ABPP表明醛酮还原酶家族7成员A2（AKR7A2）是LX-2细胞中GA的主要结合蛋白。CETSA、荧光共定位、分子对接和表面等离子体共振进一步验证了GA与AKR7A2的结合。WB结果表明，GA在体外和体内均上调AKR7A2的表达，并得到siRNA实验的证实。GA靶向LX-2细胞中的AKR7A2，以防御持续的氧化应激损伤，从而抑制活化HSC的增殖并逆转肝纤维化。

论文ID

原名：Glycyrrhizic acid ameliorates hepatic fibrosis by inhibiting oxidative stress via AKR7A2

译名：甘草酸通过AKR7A2抑制氧化应激改善肝纤维化

期刊：Phytomedicine

IF：6.7

发表时间：2024.7

通讯作者：王继刚、郭秋岩、王培利

通讯作者单位：中国中医科学院中药研究所和中国中医科学院西苑医院

实验设计

结果

1.GA改善CCl4诱导的小鼠肝纤维化

动物实验结果表明，在整个治疗周期内，各组的体重没有显著差异（图1B）。然而，CCl4小鼠的肝脏和脾脏重量显著增加，对应于肝脏和脾脏系数显著升高，对肾脏没有显著影响；然而，施用高剂量GA后，CCl4小鼠肝脏和脾脏的变化明显逆转（图1C）。肝纤维化伴有ALT和AST的显著升高。此外，HA、LN、PⅢP和ColⅣ是细胞外基质的重要组成部分，直接反映了肝纤维化的程度。模型构建后，ALT、AST以及HA、PⅢP、ColⅣ和LN的血清水平升高，GA给药后降低（图1D）。

2. GA改善CCl4诱导的小鼠肝脏病理

HE染色显示，与Con组相比，Mod组小鼠肝脏有明显的炎性细胞浸润，肝细胞散布不规则排列，纤维组织伴有明显的出血性变化。GA处理的小鼠肝脏显示炎症细胞浸润减少，肝细胞排列整齐，肝小叶结构更完整，肝脏形态显著改善（图2A）。Masson染色显示，在Mod组的肝脏中，大量蓝色胶原纤维和染色颜色较深的粗纤维条从汇合区域周围向外延伸。GA给药后，中心静脉周围和整个观察区域的蓝色胶原蛋白显著减少（图2B）。天狼星红染色显示，红色胶原纤维明显沉积在纤维化肝组织的黄色肌肉和神经胶质细胞沉积物周围。GA给药显著抑制了红色胶原蛋白的沉积（图2C）。偏光显微镜观察显示，I型、II型、III型和IV型胶原纤维呈黄色或红色，多色、绿色和黄色，纤维化肝脏中的所有类型胶原纤维均从汇合区向外扩张，大量I型胶原纤维、III型胶原纤维和少量II型和IV形胶原纤维沉积。GA处理后，胶原蛋白的所有颜色都减少了，I型和III型胶原蛋白的变化尤为明显（图2D）。对各种病理染色结果的综合分析表明，GA显著改善了肝脏形态，显著减少了肝脏组织中的炎性细胞浸润和胶原沉积，并显著逆转了小鼠的肝纤维化。

3.蛋白质组学鉴定肝纤维化小鼠GA的关键途径

我们对Con、Mod和GA高剂量组的肝组织进行了全蛋白质组测序。MS结果显示，与Mod组相比，Con和GA给药组中有14种蛋白质上调，比值>2（图3A）。这些蛋白质是Mmrn2、Cggbp1、Pld1、Gstm3、Cbr3、Gsta1、Gstm1、Gstm2、Ighg1、Nqo1、Ighv1-72、Gstm4、Hspa1l和Orm2（图3B）。GO分析表明，差异蛋白Gstm1、Gstm2、Gstm3、Gstm4和Gsta1主要参与GSH代谢、外源分解代谢、脂质代谢和其他生物过程。细胞成分主要涉及细胞间桥、细胞质和细胞外区域。分子功能主要与GSH结合、GSH转移酶活性、NADPH脱氢酶（醌）活性、蛋白质同二聚化活性和酶结合位点有关（图3C）。KEGG结果表明，Con/Mod和GA/Mod比值均>2的DEP主要调节GSH代谢、化学致癌ROS和细胞色素P450对外源性物质的代谢等。Con/Mod和GA/Mod比值均小于0.8的DEP主要调节花生四烯酸代谢、视黄醇代谢、类固醇激素生物合成等（图3D）。

4.GA清除LX-2细胞内ROS以维持活化HSC的稳态

为了观察GA在肝损伤发展过程中引起的变化，我们对正常肝细胞BLR-3A、HSC LX-2和肝癌HepG2细胞进行了细胞存活率测定。CCK8实验的结果表明，GA对BLR-3A细胞没有显著影响，但在12.5μM的浓度下开始抑制LX-2细胞，在216.4μM时达到LX-2细胞50%的抑制率，在284.7μM时抑制HepG2细胞50%（图4A，B）。这些结果表明，GA对正常肝细胞没有影响，但抑制了肝癌细胞和HSC，其中HSC最敏感。荧光图显示，在50、100和200µM GA处理后，LX-2细胞内ROS的绿色荧光显著减弱（图4C）。流式细胞术检测细胞内ROS含量表明，不同浓度的GA能够显著降低LX-2细胞内的ROS水平，100和200µM的效果相当（图4D，E）。上述结果表明，GA可以减少活化HSC中的ROS，从而抑制HSC的持续增殖。

5.ABPP技术鉴定GA靶蛋白及实验验证

我们采用ABPP法鉴定LX-2细胞中GA蛋白靶点（图5A）。凝胶扫描图的结果显示，GA减弱了IAA-yne探针的荧光信号，表明GA与IAA-yne标记的蛋白质竞争性结合（图5B）。对每组差异蛋白进行MS分析，选择GA结合蛋白中丰度比最大的AKR7A2进行进一步研究（图5C）。纯化的重组AKR7A2蛋白的荧光标记与上述一致（图5D）。此外，CETSA表明，GA给药最初增加了LX-2细胞中AKR7A2的表达，与DMSO相比，其结合热稳定性显著提高（图5E）。

通过荧光共定位观察到GA和IAA在LX-2细胞中竞争性占据的蛋白质荧光。Nuclear Hoechst、IAA-yne（点击荧光试剂）和AKR7A2蛋白分别显示蓝色、红色和黄色荧光（图5F）。在DMSO处理的细胞中，只添加了具有AKR7A2荧光二抗的Nuclear Hoechst。与DMSO组相比，IAA-yne组显示出强烈的红色荧光，表明该蛋白在LX-2细胞中与IAA-yne高度结合。与IAA-yne组相比，GA和IAA-yne在LX-2细胞中竞争性占据AKR7A2，这表现为GA+IAA-yne组合中红色荧光强度显著降低，黄色荧光增强。

通过分子对接进一步预测了GA与AKR7A2的结合位点，模拟分析表明，GA以-5.47 kJ/mol的结合能与AKR7A2的氨基酸残基ARG-264、LYS-267、CYS-355、GLU-345和GLN-207结合（图5G）。此外，SPR分析在计算机上验证了分子对接方法的发现。结果表明，GA与AKR7A2显著结合，KD值为21.76µM（图5H）。这些实验表明，GA直接与AKR7A2结合。随后，基于AKR7A2和细胞球蛋白（CYGB）之间的相互作用，它们都参与ROS清除活性和氧化应激反应，从而抑制活化HSC的标志物α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达，我们进行了WB实验，发现GA给药后α-SMA水平显著降低，AKR7A2和CYGB都在一定程度上增加（图5I）。这些结果证实了AKR7A2是GA作用的靶点。

6. AKR7A2调节氧化应激抑制HSC活化的体外和体内验证

为了进一步验证GA的靶蛋白，我们将siRNA转染到LX-2细胞中以敲除AKR7A2，在引物3干扰72 h时效果最佳。在LX-2细胞中，对AKR7A2的干扰导致CYGB蛋白表达同时降低，α-SMA表达增加，表明AKR7A2确实影响HSC的活化。进一步的实验结果表明，siAKR7A2处理后，GA处理72小时，LX-2细胞中AKR7A2的表达增加，CYGB蛋白表达与AKR7A2中的表达保持一致，而α-SMA表达减少（图6A，B）。这些发现表明，AKR7A2和CYGB相互作用，参与了HSC的激活过程。

为了进一步验证GA除了对HSC细胞中AKR7A2的调节作用外，是否还会影响整个肝脏中AKR7A2的表达，我们从小鼠肝组织中提取了蛋白质来检测AKR7A2的水平。结果显示， CCl4小鼠肝组织中AKR7A2含量显著降低，与CCl4组相比，各GA给药组中AKR7A2的表达显著增加，这进一步证实了我们在细胞水平上的ABPP分析结果以及GA对AKR7O2的影响（图6C）。

作为CYGB的相互作用蛋白，AKR7A2参与ROS清除并抑制氧化应激。在细胞水平上，我们发现GA给药后LX-2细胞中的ROS含量显著降低。为了研究GA是否可以在动物水平上抑制氧化应激，我们使用小鼠血清测量SOD、MDA、GSH和CAT的水平。结果表明，GA给药显著逆转了CCl4诱导的氧化损伤，导致抗氧化酶SOD、GSH和CAT水平升高，氧化产物MDA的积累减少（图6D）。其中，谷胱甘肽S-转移酶（GST）可以引起肝脏排毒和预防氧自由基损伤。结合蛋白质组学结果，可以得出结论，GA通过提高GST水平、催化GSH与外源物质的结合以及加速外源物质的分解代谢过程来抑制氧化损伤并改善肝纤维化。

肝病是一种常见疾病，严重影响人类健康，引起了全球关注。肝纤维化作为肝脏疾病进展的可逆部分，如果不进行干预，随着时间的推移可能恶化为肝硬化甚至肝癌。中国最近的一项研究表明，大约2.85%的中国成年人患有肝纤维化。肝纤维化的患病率在全球范围内也在上升，严重增加了社会的负担。目前中国市场上的几种中成药，如安络化纤丸、扶正化瘀胶囊和鳖甲软肝片，常用于治疗肝纤维化，但尚未有药物被食品药品监督管理局或中国食品药品监督管局批准专门用于治疗肝纤维化。因此，探索能够有效逆转肝纤维化并具有明确机制的靶向药物至关重要。

GA是甘草的主要活性成分，对治疗慢性肝炎有效。动物研究表明，GA通过减少肝细胞凋亡和抑制HSC活化来改善CCl4诱导的小鼠和大鼠肝纤维化。然而，GA的靶蛋白尚未确定。本研究重点研究了GA对CCl4诱导的小鼠肝纤维化和活化HSC（LX-2细胞）的影响，发现AKR7A2参与了这一过程。

大量研究表明，CCl4诱导的动物模型可导致肝细胞凋亡和肝纤维化，CCl4刺激大鼠或小鼠产生的病理变化与人类对肝纤维化的反应相似。患有肝纤维化的小鼠遭受肝损伤，导致转氨酶显著升高，血液中细胞外间充质成分增加。基于该模型，我们发现高剂量的GA显著降低了CCl4诱导的小鼠血清ALT、AST、HA、P III P、ColⅣ和LN水平，肝组织中的纤维沉积显著减少。肝组织蛋白质组学结果表明，GA主要作用于参与GSH代谢过程的Gstm1、Gstm2、Gstm3、Gstm4和Gsta1。GST催化GSH与一些内源性或外源性有害物质结合，形成无毒且易排泄的衍生物，在解毒和免疫调节中发挥作用。除了解毒的综合作用外，谷胱甘肽也是一种重要的抗氧化剂，可以减少ROS的积累，保护细胞免受氧化应激。KEGG结合GO分析表明，GA通过II期代谢酶GST加速外源物质代谢和抑制氧化应激来预防肝纤维化。GA表现出的显著抗肝纤维化作用使其靶点的研究变得重要。

氧化应激与肝纤维化的进展密切相关，并因多种病因而参与肝纤维化的临床病例和动物模型。HSC活化是肝纤维化的核心。活化的HSC会产生大量的ROS，引发肝脏持续的氧化应激状态。ABPP对标记蛋白的MS分析表明，GA作用于LX-2细胞中的AKR7A2。AKR7A2是醛/酮还原酶超家族的成员，依赖NADP（H）将醛和酮还原为酒精，主要存在于肝脏和肾脏等组织中，对脂质过氧化产生的醛具有催化活性，因此在防御ROS以逆转氧化应激方面发挥作用。AKR7A2在功能上与CYGB相似。CYGB在HSC中高度表达，可以保护细胞免受ROS的侵害，并应对细胞内的氧化应激。AKR7A2作为CYGB的相互作用蛋白，参与ROS清除和氧化应激反应，在抑制肝纤维化中起着重要作用。

为了验证GA对LX-2细胞靶点的准确性，除了体外si-RNA干扰实验外，我们还进一步检测了体内肝纤维化小鼠肝组织中AKR7A2的表达。我们发现GA不仅在活化的HSC中增加了AKR7A2的表达，而且在整个肝脏中也有增加。众所周知，氧化应激与ROS的增加或抗氧化防御的降低有关。氧化产物的清除率取决于GST或醛/酮还原酶的解毒率。为了进一步评估AKR7A2介导的GA在肝纤维化小鼠中的抗氧化能力，我们检测了血清中SOD、CAT、GST和MDA的水平。结果表明，GA显著逆转了CCl4引起的氧化损伤，导致抗氧化酶SOD和CAT以及抗氧化物质GSH显著增加，脂质过氧化产物MDA显著降低。综合体内和体外实验表明，GA靶向AKR7A2清除活化HSC中的ROS，抑制氧化应激，使HSC保持静止状态，并抵抗肝纤维化（图7）。

图7 ABPP技术揭示的GA通过AKR7A2抑制氧化应激来改善肝纤维化的结构图

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.phymed.2024.155878

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