Adv Sci：杨梦甦团队综述细胞外囊泡制备与分析的最新进展

编辑丨王多鱼

题图丨Pixabay

细胞外囊泡（EV）研究在生命科学领域迅速崛起，因其在疾病诊断、药物递送和治疗中的潜在应用受到广泛关注。然而，EV固有的异质性和复杂性使得其制备、分析以及临床应用面临显著挑战。

近期，香港城市大学深圳福田研究院杨梦甦团队（博士生王泽圣为第一作者）在Advanced Science期刊发表了题为：Extracellular Vesicle Preparation and Analysis: A State-of-the-Art Review 的综述论文。

该文章综述了细胞外囊泡（EV）的发展历史、组成和来源，详细讨论了最新的EV制备和分析技术，重点关注了人工智能和新型电化学传感器的新方法，以及单个EV的分析研究。

一、EV基本概述

根据MISEV2023指南，细胞外囊泡（EV）被定义为细胞分泌的、由脂质双层包裹且不具备自我复制能力的颗粒。其形成机制复杂，主要分为三种亚型：外泌体、微囊泡和凋亡小体。外泌体通过细胞膜内陷和多泡体（MVB）成熟形成，微囊泡则通过细胞膜外突形成，而凋亡小体在细胞凋亡过程中由细胞膜内陷形成。EV包含多种生物活性分子，包括蛋白质、核酸、脂质和代谢物（图1）。这些分子在细胞间通讯中起着关键作用，并在生理和病理状态下具有重要功能。例如，EVs中的蛋白质包括细胞骨架成分、四跨膜蛋白、膜融合蛋白等，核酸包括mRNA、miRNA等。这些分子的研究不仅有助于理解疾病的发生发展，还能帮助识别早期诊断和预后评估的潜在生物标志物。

图1：两种主要类型的细胞外囊泡（外泌体和微囊泡）生物生成途径概述，以及外泌体的结构示意图

二、EV的分离制备

有效的EV制备是基础科学研究和临床应用的前提。现有的制备方法包括超速离心、密度梯度离心、尺寸排阻色谱、超滤、聚合物沉淀和免疫磁珠法等，都存在各自的缺陷。近年来，数字微流控、惯性微流控、确定性横向位移阵列、声控和磁控等微流控设计，以及切向流过滤、非对称流场流分离和阴离子交换色谱等新方法进一步扩展了EV的制备方法。同时，最新的纳米技术如纳米颗粒、纳米孔结构、纳米线和纳米DNA水凝胶等（图2），极大地促进了EVs的制备技术的发展。

图2：纳米技术用于EV分离的研究

三、EV的分析进展

由于EV的纳米级尺寸和低丰度的生物活性成分，导致EVs的分析具有挑战性。现有的分析方法包括透射电子显微镜（TEM）、动态光散射（DLS）、原子力显微镜（AFM）等，这些方法可以评估EV的大小、形态、表面电荷和浓度。此外，生物化学分析方法如蛋白质印迹法（WB）、酶联免疫吸附测定（ELISA）、质谱（MS）等，可以对EV中的蛋白质、核酸、脂质和代谢物进行详细分析。但随着对EV分析的灵敏度和特异性要求越来越高，传统的群体分析方法往往难以解析EV群体中的异质性，从而限制了我们全面理解EV复杂性的能力。因此，单EV分析技术不断被报道，例如纳米流式细胞术、ExoView平台、超分辨荧光成像、SPR技术和单颗粒暗场成像等，这些方法显著推动了单个EV分析的发展。同时人工智能的应用也极大地促进了EV分析进步（图3）。通过机器学习和深度学习算法，可以对EV进行分类、预测其货物内容，甚至推断其潜在的生物效应。例如，SERS结合深度学习算法，能够高效分析血浆中EV蛋白质的拉曼光谱，从而进行疾病的非侵入性诊断。

图3：人工智能结合表面增强拉曼散射（SERS）在EV分析中的进展

四、EV研究的挑战与未来展望

尽管EV在生物医学领域显示出巨大潜力，其临床应用仍面临诸多挑战，包括制备EV的质量、分析技术的特异性和分辨率不足、标准化以及对其生成机制和细胞摄取机制等的理解不足。为克服这些挑战，未来研究需要在以下几个方面加大力度：

1）高通量且成本效益高的自动化EV制备：开发新的自动化设备和流程，提高EV的制备效率和质量。

2）单个EV的多参数分析技术：进一步优化和开发能够对单个EV进行全面分析的技术。

3）EV的多组学整合分析：利用人工智能和大数据技术，将不同组学数据整合起来，提供更全面的生物学信息。

4）使用先进的计算机算法进行EV数据分析：开发新的AI算法，提高EV数据分析的精度和速度，帮助揭示EV在生物学和医学中的作用。

综上所述，EV的研究相比过去取得了显著进展，但离真正走向临床应用，还需要通过跨学科的合作，包括基础细胞生物学、临床医学和计算科学的结合，为其在疾病诊断、治疗和药物递送中的应用铺平道路。展望未来，EV应用的前景光明，但需要持续的努力和投入来应对发展过程中的各种挑战。

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/advs.202401069