啮齿类动物不设置TK卫星组的可能路径-微量采样

ICH S3A指南中明确提出，对于毒理试验，需要采集生物样品用于毒代动力学（Toxicokinetic, TK）研究，以评估暴露量-效应关系。对于啮齿类动物，通常采用设置卫星组的方式进行TK研究，目的是确认药物引起的可能的血液中生理学变化是药物相关的，而非频繁采血导致的。随着采样技术的进步，目前已经可以实现微量采样。相较于传统采用>200μL的体积，微量采样仅收集≤50μL，更符合3R原则。那么问题来了，微量采样可以不再单独设置卫星组，直接在主研究组采集吗？会对动物其它毒理学终点的评价产生影响吗？AstraZeneca对2014-2021年间开展的52项大鼠毒理研究试验进行了回顾性分析，评估主研究组微量采样、大量采样或不采集TK对血生化和血液学数据的影响。

52项研究均为1个月重复给药GLP毒理试验，选取其中阴性对照组数据进行分析，其中15项为微量采血项目，10项为传统大量采血项目，其余为未进行TK采样的项目。所有研究均在第4周收集临床病理（血液学和血生化）样本，约采集1.4-2.4mL血液。对于微量采样的试验，TK样本收集按照复合采样设计，采样当天，每只动物采集3-4次血液，24h内采集0.096-0.128mL。对于大量采血的试验，每只动物24h内收集0.2-1mL。出现采血体积差异的原因是不同试验采血设计有区别，有的试验每只动物24h内采集1次，有的则次数比较多。

先看下对血液学结果的影响。共评估了 WBC 、 RBC 、 HGB 、 HCT 、 BASO 、 EOS 、 LUC 、 LYMPH 、 MCH 、 MCHC 、 MCV 、 MONO 、 NEUT 、 PLT 、 RDW 、 RETIC 在内的 16 项血液学相关指标。与无 TK 采样的试验相比，微量采样发现其中 3 个指标具备统计学意义上的差异，且都发生在雄性动物中。与无 TK 采样动物比，微量采样雄性动物 NEUT 升高 31% 、 MCV 降低 3.2% 、 MCH 降低 4.2% 。从动物福利角度看， MCV 和 MCH 降低幅度很小，也未见其它关键血液学参数的变化。从毒理学视角，这两个指标的变化并不会对毒理研究引入额外风险。 NEUT 绝对值从 0.97 （ 109/L ）的基线值增加了 0.301 （ 109/L ），虽然百分比看似增加很多，但绝对值增加有限，从该指标的毒理学视角分析，也不具备毒理学意义。

类似的是，大量采样的动物也发现 3/16 指标出现统计学意义的异常。 RBC 在雄性、雌性动物中分别降低 5.8% 和 8.9% ， HCT 分别降低 6.9% 、 9.8% ， HGB 分别降低 5.5% 、 8.0% 。以上指标的改变，与大体积采血有关。从毒理学角度解读，这些变化意味着红细胞参数的轻度降低，需要在对研究结果解读时将这一情况考虑在内。尤其是供试品本身对红细胞有一定毒性作用的情况。因此，如果 TK 采用传统大体积采血，还是建议单独设置卫星组，以减少对其它毒理学终点的影响。

看下对血生化结果的影响。共评估了 A/G 、 ALB 、 ALP 、 ALT 、 AST 、 CA 、 CHOL 、 CL 、 CREAT 、 GLOB 、 GLUC 、 K 、 SODIUM 、 PHOS 、 TPROT 、 TRIG 、 UREA 在内的 17 项指标。 TK 微量采样未见对血生化造成影响。大量采样出现 1/17 指标异常，雌性动物 TRIG 出现 12.2% 降低。不过，无论从毒理学角度和动物福利层面， TRIG 的这一变化幅度都没有太大的担忧。

AstraZeneca研究的结论很明确，而且与之前很多类似研究结果也是一致的，微量TK采样可以伴随在主研究组中进行，大量采样则建议设置单独的卫星组。微量采样（≤50μL）的优势包括采血体积少，动物痛感和应激减弱，改善动物福利，解决3R中的“refinement”问题；不需要设置卫星组，减少动物使用数量，实现了“reduction”。尤其是小鼠，能大大减少动物使用数量。还有一个很大的优势，微量采样可以实现安全性数据和暴露量出自同一动物的目标，更有利于毒理学结果的解读。最后一点，动物数量的减少也意味着供试品用量的降低，可以节约供试品。

那么微量采样适用于哪些药物？哪些安全性研究呢？

通常微量采样适用于绝大多数药物，包括生物药。核心考量点是检测方法的灵敏度，需要确定微量采样体积能否满足检测要求。

微量采样可以应用于任何毒理学研究中，包括单次给药毒性试验、重复给药毒性试验、致癌性试验、幼龄动物毒理试验和生殖毒性试验。

那么监管机构对于微量采样的态度如何呢？不设置TK卫星组，是否会有注册风险？

FDA于2018年针对微量TK采样出台过一部指南，《S3A Guidance: Note for Guidance on Toxicokinetics: The Assessment of Systemic Exposure in Toxicity Studies: Focus on Microsampling》. 首先，FDA对微量采样的态度是积极的，允许在毒理研究中通过微量采样技术收集TK样本。不过，指南中也建议实际操作中需要结合采血体积、采血次数、供试品特点（如是否对红细胞、凝血等参数有影响）、试验系统（如动物种属、年龄、体重、总血量）、采血位置等综合考量。可通过前期研究，先行验证是否与平行设置的对照组在血液学参数、采血位点反应（如组织损伤、炎症）等方面有区别。如果有，则还是建议设置单独的TK卫星组。如果没有，自然可以伴随主研究组收集TK。

AstraZeneca的经验显示，迄今为止，其申报FDA的包含微量TK采样伴随在主研究组设计的资料中，尚未收到过任何来自监管机构的挑战和负面反馈。所以，药企可以根据自身产品特点，合理优化毒理试验设计。

转载请经过作者同意，谢谢！