Nat Commun | 哈工大王广福团队揭示参与空间认知的新视觉通路

在动物进行空间导航的过程中，从环境中获得准确的信息并确定自己的位置是一个关键问题，动物从环境中获取视觉信息、听觉信息和嗅觉信息等，将这些信息整合到内侧内嗅皮层（Medial Entorhinal Cortex, MEC）和海马来建立对于环境的认知地图。然而，视觉皮层的信息输入到MEC的具体路径还不清楚。

2024年5月15日，哈尔滨工业大学大学王广福团队在Nature Communication上发表了名为A non-canonical visual cortical-entorhinal pathway contributes to spatial navigation的研究，揭示了一条传输视觉信息的非典型通路，即V1→V2→MEC L5a，为感觉信息如何在空间认知中发挥作用提供了神经机制上的新理论基础。

MEC L5a的神经元响应于视觉刺激

在文章第一部分，作者用常见的c-Fos蛋白表达来验证视觉刺激对MEC神经元的影响。小鼠在黑暗环境中生活1-9天后，开灯给予一段简单的光刺激，发现其c-Fos在视觉相关脑区和MEC中的表达量都会显著上升，而夹断了视神经的小鼠没有这种表现，说明MEC神经元对光刺激的响应需要完整的视神经回路。并且他们发现，c-Fos蛋白主要表达在MEC的第5a层（layer 5a），并且大多数L5a中c-Fos阳性神经元为兴奋性神经元，而L5b中则有一半的c-Fos阳性神经元为抑制性神经元。此外，突然的光刺激也激发了一些视觉皮质亚区如海马腹侧CA1 (vCA1)区域和中部CA1 (iCA1)中神经元表达c-Fos,但没有激活那些恐惧焦虑相关的脑区。

V2与MEC L5a存在单突触连接

H129-hUbC-HBEGFP能够顺行示踪，从一个神经元扩散到其连接的下一个神经元。通过在病毒注射后的不同时间点采样可以观察其在神经回路中的扩散路径，从而区分跨单突触和跨多突触的连接。向视觉皮层V1注射这种病毒48 h后，在V１的下游如LGN、V2L都观察到了绿色荧光，但是在MEC则没有；在注射60 h后收集样本则发现MEC的腹侧尾部（ventral cauda entorhinal cortex，vCE）的L5a也表达了绿色荧光，且荧光表达局限在MEC外侧部分区域，和之前c-Fos的表达区域重合。这些结果表明V１到MEC可能不存在直接投射，而是有经过V２之类区域的跨突触连接。

为了进一步验证之前的结果，研究人员使用了跨单突触的HSV1 H129变体（H129-ΔTK-EGFP）。这种病毒删除了胸苷激酶（TK）基因，在辅助病毒的帮助下，仅标记突触后神经元。通过将辅助病毒和H129-ΔTK-EGFP分别注射到小鼠的视觉皮层V2M或V2L区域，在MEC L5a均发现了荧光表达，且V2M主要靶向对侧vCE L5a，而V2L则靶向对侧dCE L5a。通过进一步的全细胞记录和形态重建，研究者发现V2M和V2L倾向于靶向不同亚型的vCE L5a锥体细胞，分别是水平基底树突细胞（horizontal basal dendrites，HBDs）和扇形基底树突细胞（fan-shaped basal dendrites，FBDs）。这些数据表明，V2M和V2L投到MEC的轴突具有不同的空间分布，并对不同形态的神经元群体具有靶向的偏好性。这些结果揭示了一条经由V1到V2再到vCE L5a的视觉信号传递路径。

多个高阶视觉区域参与到V1→V2→MEC L5a通路

在啮齿动物的V2也存在一些子区域，如外侧中区（lateromedial，LM）、外侧中间区（laterointermediate，LI）和前外侧区（anterolateral，AL）等。接下来，作者探究了这些区域在V1→V2→MEC L5a神经回路中的作用。通过注射逆行示踪剂，研究发现MEC L5a的神经元也投射到V2L和V2M。通过使用狂犬病毒示踪剂进一步追踪MEC L5a的突触前神经元，发在V2M和V2L中存在L5a的突触前神经元，而在V1没有，这些神经元主要分布在LM、LI、P、AL、AM、PM和POR中。进一步实验表明，多个V2子区域直接接收来自V1的投射，并支配MEC L5a，证明了V1→V2→MEC L5a通路的存在。

V2的输入引起L5a的兴奋性和抑制性突触活动

之前已经验证了V2与MEC L5a之间存在相互投射，接下来作者通过光遗传学实验进一步验证了V2→MEC L5a通路中的功能性突触连接。他们将表达ChR2的病毒注射到V2M和V2L，然后通过给光激活这些区域的传入神经，在下游的MEC L5a锥体细胞中成功记录到了兴奋性和抑制性突触后电流（EPSCs和IPSCs）。结果表明，这些突触是谷氨酸能的单突触连接。此外，IPSCs相比EPSCs的起始潜伏期较长，说明IPSCs可能是由局部抑制性神经元介导的多突触抑制引起的。由V2M引发的反应比V2L引发的更强，这可能与它们在MEC中的投射纤维分布的不同有关。这些发现揭示了V2区域在视觉信号传递到MEC中的具体机制。

V2→MEC L5a回路在MEC和海马中的下游靶点

之后，通过向V2L注射H129-hUbC-HBEGFP发现在vCE L5b和L6接受V2输入的神经元主要是中间神经元，一些是SOM阳性神经元，一些是PV阳性。６０ｈ后，在MEC浅层和海马CA1区也发现了一些表达绿色荧光的神经元，且vCE L5a的绿色荧光神经元中中间神经元的比例增加，证明L5b和L6的中间神经元是由接收V2投射的L5a神经元介导的。进一步的光遗传学研究、全细胞膜片钳记录和药理学实验表明，这些接收V2输入的L5a神经元通过单突触兴奋性连接和多突触抑制性连接，将来自V2的输入分配给其周围的中间神经元，特别是SOM中间神经元，以及海马CA1和MEC表层神经元，在视觉信号传递整合中发挥关键作用。

MEC L5a背腹路径（DV pathway）将视觉信息传递到海马和表层MEC

通过将逆行病毒AAV2retro-CAG-mCherry注射到MEC L2/3或海马iCA1/vCA1区域，以及将顺行跨多突触病毒H129-hUbC-HBEGFP注射到V1，发现MEC L5a的神经元一部分只接受来自V1/V2的视觉信息输入（主要分布在vCE），另一部分只负责将视觉信息输出到表层MEC和海马(主要分布在ME)，一部分神经元则在接收视觉信息输入的同时也直接传递信息给在空间认知中发挥主要功能的浅层MEC及海马。此外，通过光遗传学实验激活vCE L5的SOM阳性中间神经元和接受V2投射的L5a神经元，都可以诱发EPSCs，且在一会后会在L5a中形成IPSCs，而抑制SOM中间神经元则可以抑制IPSCs的产生, 增强EPSCs。这说明vCE L5a的SOM中间神经元介导接收V2投射的vCE L5a神经元到ME L5a的前馈抑制。

V2→MEC L5a 通路在空间认知中起重要作用

通过之前的研究，已经可以确认存在V2→MEC L5a这样一条通路，后续研究者进一步探索了这条通路是否参与到视觉刺激引起的MEC中c-Fos表达的过程。通过注射AAV2/9-hM4Di-EGFP来抑制V2后，在光刺激下MEC L5a神经元产生的c-Fos显著减少；通过光纤结合钙成像记录，发现接收V2投射的vCE L5a神经元在光刺激下钙离子信号增强，V2M或V2L失活的情况下则信号减少。这些结果证明V2在MEC L5a神经元的活动中起到直接关键的作用。之后，他们进一步证明了MEC L5a在小鼠进行空间导航任务中发挥重要作用。如果抑制接收V2投射的MEC L5a神经元的活动，小鼠在水迷宫任务（Morris Water Maze, MWM)和探针任务（Probe task）的表现明显下降，穿越平台的次数显著降低。之后，他们记录了在小鼠进行任务过程中的vCE L5a的神经元活动，发现钙信号会随学习过程而加强，且在视觉信息受损的黑暗条件下这些神经元活动减弱，小鼠的任务表现也下降。后续的光遗传学实验进一步证明了V2→MEC L5a的直接投射在空间导航中发挥关键作用。

注：

水迷宫任务（Morris Water Maze,MWM）是一种经典的空间学习和记忆实验，通常在一个充满不透明水的直径为1-2米的圆形水池进行，在水面下会有一个隐藏的平台，位置在整个任务中保持不变。在训练阶段，小鼠被放入水池，并需要找到并爬上隐藏的平台。在训练过程中，需要记录小鼠找到平台所需的时间（称为潜伏期），随着训练次数的增加，潜伏期通常会减少，这表明小鼠学到了平台的位置。

探针任务（Probe task）通常在MWM训练阶段结束后进行，用于进一步评估小鼠的空间记忆能力。探针任务仍然在相同的MWM水迷宫中进行，但此时移除了之前MWM的隐藏平台。小鼠会被放入水池中，记录其游泳路径和在过去平台所处的象限中花费的时间。如果小鼠记得平台的位置，它会在平台所在的象限花费更多的时间，穿越平台位置的次数会更多。

总结

该研究揭示了一条非典型的视觉皮层投射到MEC的神经回路，即V2→MEC L5a。该路径提供的视觉输入不仅到MEC L5a，还可以传递到浅层MEC和海马，对MEC相关的空间导航功能十分关键，并参与情景记忆的编码。

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