元英进团队：通过先进工程策略实现木质素高效转化为高均质性PHA

木质素是木质纤维素生物质的主要成分，是地球上最大的可再生芳烃来源，可用于生物精炼和造纸工业，全球木质素的年产量已上升到约 5000 万吨。然而，以焚烧或堆放填埋处理木质素废物的传统方法存在资源利用效率低下和严重的环境污染问题。随着人们认识到木质素作为生物燃料、化学品和工业品材料的巨大潜在价值，其废物利用逐渐成为可持续生物经济领域的热门课题。

聚羟基链烷酸酯（PHA）是一种由微生物合成的可生物降解聚酯，具有优异的生物相容性和热力学性能，可用于生产可生物降解材料、化妆品中的生物基美容面膜和医疗领域的手术缝合线。然而，高昂的原材料价格阻碍了 PHA 的商业化应用。

近年来，将木质素转化为 PHA 的微生物转化方法已被充分证明有广阔的发展前景。例如利用恶臭假单胞菌的特殊“生物漏斗”途径，可以将木质素衍生的芳香剂（如对香豆酸（p-CA）和阿魏酸（FA））转化为生产 PHA 的关键中间体，然而，其转化效率受到分馏方法、菌株类型、底物等多种因素的影响。此外，合成生物学方法、基因工程和优化发酵策略等途径，均在不同程度上进一步改善了木质素转化效率问题和 PHA 组成的均一性问题。

近日，来自天津大学的研究团队通过设计先进的工程策略，改善了 PHA 的积累并调节了其单体组成。通过阻断 PHA 降解途径、增强 PHA 合成和重写 β 氧化途径，成功构建了工程化恶臭假单胞菌 KT2440。通过将这些策略与补料分批发酵相结合，工程化恶臭假单胞菌菌株产生的 PHA 含量最高达到 2.46 g/L，比分批模式提高 143.6%，同时 PHA 单体比例最大达到 91.4%。当利用真实的木质素水解产物作为底物时，该菌株还表现出了强健的生长能力，并以高达 85% 的高均匀性产生了 0.93 g/L 的 PHA。

这篇文章已经以“Valorizing Lignin and Coprecursors into Homogeneous Polyhydroxyalkanoates by Engineered Pseudomonas putida”为题发表在ACS Sustainable Chemistry & Engineering上。该研究团队的负责人是天津大学元英进院士，他主要从事人工基因组设计合成、基因组重排、DNA 信息存储、天然产物人工生物合成、以及生物过程强化等领域的研究。

在这项研究中，研究团队首先评估了将木质素衍生的芳香族化合物和其他不同碳源（如葡萄糖、醋酸、甘油和脂肪酸）共同喂养假单胞菌 KT2440 对于 PHA 产量的影响。结果表明，碳源组合不仅影响 PHA 产量，还可以调控其单体组成。其中，脂肪酸对 PHA 产量的影响最为显著，随碳链长度增加促进作用提高，而且不同的碳源组合对于 PHA 的单体成分及比例的影响也各不相同。例如，与仅喂养 FA 相比，共同喂养 FA 与辛酸在 24 小时内产生了 0.56 g/g 干重细胞的 PHA 含量和 0.92 g/L 的 PHA 滴度，增幅分别高达 75% 和 130%，而选择庚酸或辛酸时，PHA 单体的主要组成分别为 3-羟基庚酸酯（3HHp）和 3-羟基辛酸酯（3HO）。

随后，他们观察到恶臭假单胞菌 KT2440 中的 PHA 含量随着发酵时间的延长而逐渐降低，分析认为，PhaZ（一种编码 PHA 解聚酶的基因）基因在 PHA 降解过程中起着至关重要的作用。研究人员通过删除 KT2440 的PhaZ基因获得菌株KTYY01，其在 p-CA 作为唯一碳源时，PHA 含量和浓度分别增加了 37.5% 和 35.7%；在与辛酸共同喂养下，PHA 产量比KT2440 增加了 63.6-84.2%。与 FA 共同喂养也有类似的促进效果，当与辛酸共同喂养时，PHA 含量和浓度比 KT2440 分别增加了 23.2% 和 43.5%。与此同时，他们发现 PhaZ 基因的缺失不会影响 PHA 的单体组成，并且还有助于在碳饥饿条件下的长期培养。

此外，研究团队采取了遗传工程手段以提高 PHA 的合成效率和调节其单体组成。PhaG、PhaJ4 和 PhaC 这三个基因分别在（R）-3-羟酰基-ACP 转化为（S）-3-羟酰基脂肪酸、反式 Δ2-烯酰辅酶 A 转化为底物（R）-羟酰辅酶 A 以及将（R）-羟酰辅酶 A 聚合成 PHA 聚合物的过程中起关键作用，通过过表达这三个基因，他们成功引导了更多的碳通量进入 PHA 的生物合成。在此基础上，通过敲除无关基因 aldB 来过表达 PhaC 基因构建了假单胞菌 KTYY04 菌株，该菌株在 p-CA 和辛酸共同喂养下，除了 PHA 含量和浓度显著增加外，还将 PHA 中 3HO 的含量从 50% 提高到 76%，实现了对 PHA 单体组分的实质性控制，而 FA 与辛酸的共同喂养条件下，3HO 的成分比例更是高达 80%。

后来，研究人员分析认为 PHA 可以从脂肪酸 β 氧化途径衍生的中间体合成，因此，他们敲除 FadBA 基因获得了 KTYY06 菌株，该过程破坏了脂肪酸的 β 氧化途径并产生了 3-羟酰辅酶 A 前体，将奇链脂肪酸和偶数链脂肪酸联合起来作为前体来调节 PHA 的单体成分。研究发现，敲除 FadBA 基因导致 KTYY06 菌株在消耗短链脂肪酸的能力下降，但与庚酸或辛酸等中链脂肪酸共同喂养 p-CA 或 FA 时，可以改善细胞生长并促进 PHA 的积累和调节单体组成。

考虑到使用芳香族底物时，随着底物浓度的增加，PHA 的生产可能会受到限制，研究团队进一步设计了各种发酵策略，以在共同喂养芳烃和有限脂肪酸时促进细胞生长和 PHA 积累。他们采取了五种补料分批发酵模式（F-BM1、F-BM2、F-BM3、F-BM4、F-BM5），其中，F-BM1使用低浓度的 p-CA 和辛酸作为低氮条件下的碳源开始发酵，F-BM2 则增加了 p-CA 浓度，它将干燥细胞的 PHA 积累提高到 0.84 g/g，并将 PHA 浓度提高到 2.46 g/L，使得 PHA 的积累量和浓度在分别增加 47.4% 和 143.6% 的同时保持了高达 91.4% 的最大单体比例。F-BM3、F-BM4 和 F-BM5在第一个循环中使用高氮浓度，在第二个循环中使用低氮浓度，这些模式虽然提高了 PHA 的均匀性，但并未比 F-BM1 和 F-BM2 进一步改善 PHA 积累，分析认为可能是由于高氮浓度不支持 PHA 的积累，芳香族底物浓度的升高对细胞生长产生了不利影响。

最后，研究团队评估了使用恶臭假单胞菌 KTYY06 菌株从真实木质素流和碱性预处理液（APL）中生产 PHA 的实用性和效果。研究结果显示，KTYY06 菌株能够在含有真实木质素水解物的培养基中生存并生长。当仅以木质素衍生物为生长来源时，PHA 的积累较少；而共同喂养辛酸前体可以促进细胞生长和 PHA 积累，通过共同喂养辛酸，干燥细胞的 PHA 含量达到 0.32 g/g，浓度达到 0.93 g/L，PHA 中的单体组成主要成分是 3HD，成分比例达到 85%，这同样改变了 PHA 的物理特性，使其成为一个低结晶度的软聚酯，具有更柔软的性质。

综上所述，这项研究通过基因修饰、前体调控和发酵优化的多维方法在产生高均质性PHA方面显示出巨大的前景。这种新颖的生产策略具有重大意义，为高级应用提供了具有独特性能的定制PHA。

参考资料：

1.https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssuschemeng.4c01184