《食品科学》：西北民族大学高丹丹教授等：牦牛乳酪蛋白抗氧化肽对HEK293细胞氧化应激损伤的保护作用

活性氧（ROS）在机体的细胞氧代谢过程中产生并发挥重要作用，当人体遭受疾病或外界刺激时，ROS大量产生导致细胞损伤，从而引起各种慢性疾病或并发症。临床上通过服用VE、VC、β-胡萝卜素和类黄酮等抗氧化剂来清除体内多余的ROS，然而，长期摄入这些化学合成抗氧化剂对人体有一定的潜在毒性。相较于化学合成的抗氧化剂，食源性抗氧化肽具有更高的安全性和活性，且易被吸收利用，具有人工合成抗氧化剂不可比拟的优越性，应用潜力巨大，在医药、食品、化妆品等领域具有广阔的应用前景。

牦牛乳是青藏高原藏族牧民传统的食物来源和蛋白原料之一。本课题组前期的研究采用发酵法制备牦牛乳酪蛋白抗氧化肽，分离纯化并获得其序列，通过动物体内实验表明其具有良好的抗氧化活性，但其抗氧化作用机制尚不明确。因此，西北民族大学生命科学与工程学院的吴登宇、韦 体、高丹丹等研究采用H2O2诱导HEK-293细胞建立细胞氧化损伤模型，研究5 条牦牛乳酪蛋白抗氧化肽AFK、IEQI、FPFF、LPVPQ、RELEEL对H2O2诱导损伤HEK293细胞的存活率、丙二醛（MDA）含量、抗氧化酶类活性、还原型谷胱甘肽（GSH）和GSSG含量的影响，从细胞水平探讨牦牛乳酪蛋白抗氧化肽对H2O2诱导的HEK293细胞氧化应激的作用机制，为牦牛乳酪蛋白在食品深加工、制药和化妆品等领域中的应用提供理论依据，提升牦牛乳及其酪蛋白产业附加值。

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牦牛乳酪蛋白抗氧化肽体外抗氧化能力分析

1.1 牦牛乳酪蛋白抗氧化肽的ABTS阳离子自由基清除作用

由图1可知，随着牦牛乳酪蛋白抗氧化肽质量浓度的增加，ABTS阳离子自由基的清除能力逐渐增强，呈质量浓度依赖性，其中200 μg/mL抗氧化肽的清除能力显著高于其他4 种质量浓度，清除效果最好的是抗氧化肽LPVPQ，但牦牛乳酪蛋白抗氧化肽的ABTS阳离子自由基清除能力显著弱于VC。抗氧化肽AFK、IEQI、FPFF、LPVPQ、RELEEL对ABTS阳离子自由基清除的半抑制浓度（IC50）分别为376.55、370.53、359.71、340.33、338.93 μg/mL，在同等实验条件下VC的IC50为20.73 μg/mL。

1.2 牦牛乳酪蛋白抗氧化肽的DPPH自由基清除作用

由图2可知，5 条抗氧化肽随着质量浓度的增加，DPPH自由基清除率升高，其中抗氧化肽LPVPQ在200 μg/mL的质量浓度下DPPH自由基清除能力最高，牦牛乳酪蛋白抗氧化肽的DPPH自由基清除能力显著低于VC。抗氧化肽AFK、IEQI、FPFF、LPVPQ、RELEEL对DPPH自由基清除的IC50分别为584.38、949.09、762.95、344.30、703.99 μg/mL，相同条件下VC的IC50为76.67 μg/mL。

1.3 牦牛乳酪蛋白抗氧化肽的羟自由基清除作用

由图3可知，本研究中5 条抗氧化肽均对羟自由基具有一定的清除作用，随着质量浓度的增加，清除作用越明显，其中清除率最高的是RELEEL，VC的羟自由基清除能力显著高于牦牛乳酪蛋白抗氧化肽。抗氧化肽AFK、IEQI、FPFF、LPVPQ、RELEEL对羟自由基清除的IC50分别为407.67、811.77、447.82、780.91、369.09 μg/mL，同等实验条件下VC的IC50为74.53 μg/mL。

1.4 牦牛乳酪蛋白抗氧化肽的超氧阴离子自由基清除作用

由图4可知，随着抗氧化肽质量浓度的增加，超氧阴离子自由基的清除率升高。其中清除能力最高的是抗氧化肽LPVPQ，VC对超氧阴离子清除能力显著高于牦牛乳酪蛋白抗氧化肽。抗氧化肽AFK、IEQI、FPFF、LPVPQ、RELEEL对超氧阴离子自由基清除的IC50分别为640.18、434.41、365.29、338.14、531.18 μg/mL，相同条件下VC的IC50为75.47 μg/mL。

1.5 牦牛乳酪蛋白抗氧化肽对亚铁离子的螯合能力

从图5中可以看出，随着抗氧化肽质量浓度的增加，亚铁离子的螯合能力增强，其中亚铁离子螯合能力最强的是抗氧化肽LPVPQ，最弱的是抗氧化肽AFK。抗氧化肽AFK、IEQI、FPFF、LPVPQ、RELEEL对亚铁离子螯合能力的IC50分别为521.89、422.59、322.65、302.91、322.08 μg/mL，相同条件下VC的IC50为634.06 μg/mL。

1.6 牦牛乳酪蛋白抗氧化肽对铜离子的螯合能力

由图6可知，随着多肽质量浓度的增加，铜离子螯合能力增强，其中LPVPQ的螯合能力最强，最弱的是AFK。抗氧化肽AFK、IEQI、FPFF、LPVPQ、RELEEL对铜离子螯合能力的IC50分别为285.79、263.50、230.49、207.79、234.45 μg/mL，相同条件下VC溶液的IC50为376.82 μg/mL。

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牦牛乳酪蛋白抗氧化肽对HEK293细胞活力的影响

从图7可以看出，不同质量浓度牦牛乳酪蛋白抗氧化肽对HEK293细胞存活率的影响与对照组无显著性差异（

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H2O2浓度与处理时间对HEK293细胞活力与形态的影响

利用不同H2O2浓度（25～1 600 μmol/L）处理HEK293细胞，结果如图8所示，同一H2O2浓度下，随着处理时间的延长，细胞抑制率逐渐增大，同一时间下，随着H2O2浓度的增加，细胞抑制率也逐渐增大。因此，根据细胞抑制率在50%左右这一判定标准，得出最佳的损伤浓度和时间：800 μmol/L H2O2浓度作用3 h，400 μmol/L H2O2浓度作用12 h，200 μmol/L H2O2浓度作用24 h，由于处理时间过长、浓度过大会导致细胞存活率极低，故后续以400 μmol/L浓度的H2O2处理12 h作为诱导损伤模型的最佳条件，细胞抑制率为（46.21±0.40）%。

H2O2对HEK293细胞氧化损伤造成的形态变化影响如图9所示，对照组细胞生长良好、贴壁牢固，细胞间紧密连接呈梭形或多角形、大小均匀、边缘清晰，呈铺路石状单层镶嵌排列；25 μmol/L H2O2处理组的细胞与对照组细胞形态相似，无明显差异；50 μmol/L H2O2处理组和100 μmol/L H2O2处理组形态相似，无明显差异，均无明显损伤，但细胞数量减少；400 μmol/L H2O2处理组的细胞收缩变圆，细胞间隙增大，边界模糊，但细胞间彼此尚连；1 600 μmol/L H2O2处理组细胞损伤破裂且严重拉丝、脱落。

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牦牛乳酪蛋白抗氧化肽对 H2O2诱导的HEK293细胞氧化损伤的影响

从图10可以看出，除抗氧化肽AFK外，其他抗氧化肽对氧化损伤的细胞具有良好的保护作用，在一定范围内对细胞内的ROS具有明显的清除作用，如抗氧化肽RELEEL在50～200 μg/mL的质量浓度下具有显著的保护作用。

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牦牛乳酪蛋白抗氧化肽对HEK293细胞中MDA水平及抗氧化酶活力的影响

如表1所示，400 μmol/L的 H2O2溶液诱导HEK293细胞氧化损伤12 h后，CAT和SOD的活力极显著下降，MDA含量极显著上升，CAT活力从0.64 U/ 10 4 cells下降至0.14 U/104 cells，SOD活力从1.56 U/104 cells下降至0.42 U/104 cells，而MDA含量从0.055 nmol/104 cells上升至0.121 nmol/104 cells。与损伤组相比，经过牦牛乳酪蛋白抗氧化肽AFK、FPFF、IEQI、LPVPQ、RELEEL预处理的保护组SOD、CAT活力均有所提高，且呈浓度依赖性，而MDA经AFK、FPFF、IEQI、LPVPQ、RELEEL处理后含量均有所下降，且呈浓度依赖。

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牦牛乳酪蛋白抗氧化肽对细胞内GSH、GSSG和GSH/GSSG的影响

如表2所示，H2O2诱导氧化损伤的HEK293细胞中GSH含量极显著降低，从对照组63.92 μg/106 cells下降到了23.72 μg/106 cells。不同质量浓度的牦牛乳酪蛋白抗氧化肽保护HEK293细胞能够不同程度地提高GSH的含量，其中RELEEL（200 μg/mL）处理组细胞内GSH含量（61.17 μg/106 cells）较损伤组极显著提高（

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1）牦牛乳酪蛋白抗氧化肽体外抗氧化活性

本研究采用的5 条抗氧化肽对自由基清除作用显著弱于VC，而与VC相比，牦牛乳酪蛋白抗氧化肽具有更好的金属螯合能力，其主要原因在于牦牛乳酪蛋白抗氧 化肽的抗氧化能力与其不同氨基酸组成有关，而肽链上的氨基、羧基等活性基团在Fe 2＋ 、Cu 2＋ 螯合方面具有重要作用，这也导致了5 条抗氧化肽对不同的自由基具有不同的清除作用。含有Asp、Trp、Phe、Pro等氨基酸的活性肽对DPPH自由基和ABTS阳离子自由基清除能力较强，其主要原因与氨基酸咪唑环的螯合能力、脂类物质的诱捕能力等有很大关系。同时，当肽的N端或C端是疏水氨基酸，如Trp、Pro、Tyr、Lys、Leu、Val和His等时，其可以通过与脂质分子相互作用， 将质子注入自由基来清除自由基，从而提高抗氧化肽 的活性。本研究中LPVPQ和RELEEL的抗氧化能力较强，缘于其组成中含有抗氧化能力较强的Pro、Leu、Val，同时其结构简单，含有大量的氨基酸残基。

2）H2O2诱导HEK293细胞氧化损伤模型的构建

本研究建立细胞氧化应激损伤模 型，选取终浓度为400 μmol/L H2O2作用12 h，细胞存活率为50%左右。此状态下的损伤程度符合实验的理想状态，如果更进一步损伤细胞，则会造成损伤程度严重， 活性肽治疗效果不明显；如果损伤程度不够，则无法体现活性肽良好的生理活性。

3） 牦牛乳酪蛋白抗氧化肽对H2O2诱导HEK293细胞氧化应激损伤的保护作用

本研究考察不同质量浓 度下5种肽溶液对HEK293细胞的毒性作用，结果显示5 种肽溶液对细胞无毒性作用。通过H2O2诱导HEK293细胞氧化损伤后细胞存活率会明显下降，加入牦牛乳酪蛋白抗氧化肽后，与损伤组相比其细胞存活率显著上升， 其原因可能是加入抗氧化肽后，其抑制氧化应激，清除细胞内的ROS，具体原因需进一步深入研究。在本研究中选择牦牛乳酪蛋白抗氧化肽作为研究对象，其对氧化损伤的细胞具有显著的保护作用，然而氧化应激是一个系统而复杂的过程，需要明确牦牛乳酪蛋白抗氧化肽对氧化损伤细胞的分子机制，才能合理地对其进行开发与利用。

4）牦牛乳酪蛋白抗氧化肽对氧化损伤细胞的中抗氧化酶活力的影响

本研究结果显示，HEK293细胞经过400 μmol/L H2O2处理12 h后，胞内SOD、CAT活力以及GSH含量极显著下降（

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本研究中牦牛乳酪蛋白抗氧化肽对氧化损伤的HEK-293细胞具有一定的保护作用，可能与该信号通路也有一定的关系，牦牛乳酪蛋白抗氧化肽进入细胞后，与Nrf2-Keap1信号通路上的大分子竞争性结合，导致Nrf2与Keap1解偶联，Nrf2进入细胞核调控抗氧化酶的转录活性，从而发挥抗氧化损伤作用，也有可能是抗氧化肽直接参与细胞内ROS的清除，具体机制仍需进一步深入研究。

结论

牦牛乳酪蛋白抗氧化肽AFK、IEQI、FPFF、LPVPQ、RELEEL在体外化学清除自由基实验中均表现出一定的抗氧化活性，细胞实验中LPVPQ、RELEEL对H2O2诱导的氧化损伤细胞表现出很强的保护作用。与损伤组相比，抗氧化肽LPVPQ、RELEEL可以抑制脂质过氧化进程，维持细胞膜完整性，降低细胞内MDA含量；并且提高抗氧化酶CAT、SOD活力和GSH含量。以上结果可为牦牛乳酪蛋白抗氧化肽开发利用提供理论依据。

作者简介

通信作者：

高丹丹，西北民族大学教授，博士生导师，生命科学与工程学院食品科学与工程系主任。现任西北民族大学黄河上游畜禽遗传资源保护利用研究院副院长，生命科学与工程学院食品科学与工程系主任。主要从事食源性生物活性肽、功能性食品和畜产品加工等方面的研究工作，主持国家自然基金项目2 项，主持甘肃省科技厅项目3 项，甘肃省青年博士基金项目2 项，中央高校项目8 项；参与科技部、国家科技支撑项目等科研项目35 项。科研成果荣获甘肃省科技进步三等奖（获奖编号：2021-J3-030，第一完成人），中国乳品工业协会技术进步二等奖（排名第3），荣获甘肃省青年飞天学者、甘肃省陇原青年英才、甘肃省青年教师成才奖等荣誉称号，以第一作者和通讯发表高水平研究论文100多篇；主编专著4 部，教材3 部；授权专利27 项。甘肃省科技专家，河北省科技厅专家库专家、甘肃省首批科技特派员，担任《食品与营养科学》杂志编委，《食品工业科技》杂志青年编委，《Metabolites》、《Frontiers in Microbiology》等国际期刊主编。

第一作者：

吴登宇，女， 硕士，师从高丹丹教授，主要从事食品安全与质量控制研究。硕士期间参与导师项目，横向项目2 项，甘肃省青年博士基金1 项，中央高校基本科研业务费等项目。

本文《牦牛乳酪蛋白抗氧化肽对HEK293细胞氧化应激损伤的保护作用》来源于《食品科学》2023年44卷第23期142-150页，作者：吴登宇, 韦体, 马忠仁, 等。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20221110-115。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

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