北京化工大学谭天伟院士团队吕永琴教授课题组PNAS：人工分子伴侣介导酶重折叠

酶作为生物催化剂，在许多生物过程中发挥着重要作用。在细胞环境中，新合成的酶存在相当大的不正确折叠和聚集的风险，从而影响其功能。为了解决这些问题，细胞通过分子伴侣识别未折叠或错误折叠的蛋白质并介导其重新折叠。在工业过程中，保持酶的最佳结构和催化效率对于某些酶仍然是一个重要挑战。受细胞的启发，使用经过理性设计的材料来模拟分子伴侣，可以重新溶解和再折叠聚集或变性的蛋白质，调节蛋白质组装以治疗蛋白质错误折叠疾相关的疾病，以及在异质环境中保护蛋白质。目前的人工分子伴侣，特别是组成可调控的轻度交联的水凝胶显示出巨大的潜力。但大多数人工分子伴侣发挥的功能有限。因此，有必要探索一种通用平台，以促进理性、定制化设计分子伴侣，以实现高效的酶的再折叠。此外，科学解释人工分子伴侣的工作机制也是至关重要的。

近日，北京化工大学谭天伟院士团队吕永琴教授课题组和韩国科学技术院Sang Yup Lee院士团队合作，基于固相模板表面印迹技术，在柔性聚合物载体中构建了对变性酶具有特异性识别的“印迹腔室”，成功创制了人工分子伴侣。通过调控柔性聚合物的带电性和疏水性，人工分子伴侣可选择性地结合非天然状态酶，抑制其聚集并通过释放天然状态酶促进其重折叠，从而恢复失活酶的活性。研究成果在线发表于PNAS期刊上。

研究者以细胞色素c、漆酶和脂肪酶作为三种模型酶，建立了一个聚合物库，通过自由基沉淀聚合反应，合成并筛选了27种聚合物（nanoNIPs）。通过调节聚合物的带电性（丙烯酸AAc、（3-丙烯酰氨基丙基）三甲基氯化铵ATC、丙烯酰胺AAm）和疏水性（N-叔丁基丙烯酰胺TBAm）来精确调节与酶的相互作用，确定有利于促进失活蛋白质重新折叠的聚合物合成最佳配方。在25°C、pH 7.2-7.4条件下，将变性酶与聚合物共孵育6小时，随后通过超滤管回收重折叠酶，以回收率和相对活性验证聚合物恢复酶活的效果（图1A）。结果表明，带负电荷的聚合物能够有效地重折叠变性的细胞色素c和漆酶（图1B-G），而带正电荷的聚合物对于变性脂肪酶的酶活恢复效果最佳（图1H-J）。即带负电荷的聚合物有利于促进酸性条件具有最佳活性酶的再折叠，带正电荷的聚合物可以有效促进碱性条件下具有最佳活性酶的再折叠。在pH 7.2-7.4条件下，细胞色素c（等电点pI=9.52）带正电荷，因此，除了疏水性TBAm组分与变性细胞色素c暴露的疏水区域之间的疏水相互作用外，带负电荷的聚合物与带正电荷的变性细胞色素c之间的强亲和力同时也源于静电相互作用。相反，此条件下漆酶（pI=5.94）带负电荷，而脂肪酶（pI=7.29）则表现为电中性，因此，聚合物和漆酶或者脂肪酶之间的亲和力主要基于疏水相互作用。

图1.(A) 聚合物促进变性酶重折叠的示意图。(B) 不同带电单体（ATC、AAc和AAm）合成的nanoNIPs对变性细胞色素c的回收率和相对活性。(C) AAc投料比对变性细胞色素c的回收率和相对活性的影响。(D) TBAm投料比对变性细胞色素c的回收率和相对活性的影响。(E) 不同带电单体（ATC、AAc和AAm）合成的nanoNIPs对变性漆酶的回收率和相对活性。(F) AAc投料比对变性漆酶回收率和相对活性的影响。(G) TBAm投料比对变性漆酶回收率和相对活性的影响。(H) 不同带电单体（ATC、AAc和AAm）合成的nanoNIPs对变性脂肪酶的回收率和相对活性。(I) ATC投料比对变性脂肪酶回收率和相对活性的影响。(J) TBAm投料比对变性脂肪酶回收率和相对活性的影响。

进一步采用固相模板表面印迹技术（图2），利用戊二醛将模板蛋白交联固载在磁性纳米颗粒上，通过盐酸胍使其变性作为固相模板进行印迹，利用聚（ N-异丙基丙烯酰胺）的可逆热响应性能，在4°C条件下将印迹聚合物纳米颗粒（nanoMIPs）从磁性固相模板上释放，最终获得人工分子伴侣。通过扫描电子显微镜（SEM）和动态光散射（DLS）进行表征，其呈球形且尺寸均匀（图3 A- F）。将nanoMIP与变性酶一起孵育不同时间来测试其酶活和回收率。研究表明，人工分子伴侣对变性细胞色素c的回收率达到84.2%，对变性漆酶和变性脂肪酶的回收率分别为82.2%和70.3%（图3 G- I）。利用生物膜干涉技术（BLI）研究nanoMIPs与变性酶和天然酶之间的亲和力，以阐明nanoMIPs动态捕获变性酶以及释放天然酶的能力。如图3 J- L所示，nanoMIP [Cyt c]对变性细胞色素c的 K D值为2.59×10 -11 M，约为其天然状态的16.9倍。同时，nanoMIP [Cyt c]对于天然漆酶、脂肪酶和辣根过氧化物酶的 K D值约为10 -9 M，表明nanoMIP [Cyt c]对其模板的高选择性和特异性。同样地，与天然酶相比，nanoMIP [laccase]和nanoMIP [lipase]都对变性酶具有更高的亲和力，分别为天然酶的5.7倍和16.9倍。nanoMIPs对变性酶的更高亲和力意味着它们将优先结合变性酶，其单分子印迹腔室可抑制其发生聚集，从而促进再折叠。同样重要的是，天然蛋白与这些分子伴侣的亲和力相对较弱，使得重新折叠的蛋白质能够很容易地解离。因此，一旦变性酶恢复到其天然状态，由于结合位点不匹配，与nanoMIPs的相互作用相对较弱，它将被释放。这一机制揭示了nanoMIPs促进变性蛋白再折叠是通过两个步骤实现的。首先，变性蛋白分子通过疏水和/或静电相互作用吸附到nanoMIPs的单分子印迹腔室，随后重新折叠为其天然状态后释放（图2 B）。

图2.(A) 将蛋白固定在磁性纳米颗粒上，用盐酸胍进行变性处理，合成、富集和纯化nanoMIPs的过程示意图。(B) 使用nanoMIPs恢复变性酶的过程示意图。

图3.(A) nanoMIP[Cyt c]、(B) nanoMIP[laccase]和(C) nanoMIP[lipase]的SEM图像。通过DLS测定(D) nanoMIP[Cyt c]、(E) nanoMIP[laccase]和(F) nanoMIP[lipase]的粒度分布。(G) 与nanoMIP[Cyt c]孵育的变性细胞色素c、(H) 与nanoMIP[laccase]孵育的变性漆酶和(I) 与nanoMIP[lipase]孵育的变性脂肪酶的回收率和相对活性。使用BLI评估nanoNIP或nanoMIP[enzyme]与固定在生物传感器上的变性酶之间的相互作用：(J) nanoNIP5或 nanoMIP[Cyt c]与变性细胞色素c之间的相互作用；(K) nanoNIP2或nanoMIP[laccase]与变性漆酶之间的相互作用；(L) nanoNIP23或nanoMIP[lipase]与变性脂肪酶之间的相互作用。

nanoMIP的高选择性也通过竞争性结合实验得到验证。通过磁性模板负载带有荧光的的nanoMIP，将它们与含有天然酶和变性酶的溶液孵育1小时。在此过程中，表面结合的nanoMIP由于游离酶的竞争性结合而解离。磁分离后，测量解离的荧光强度，这对应于nanoMIP对各种靶标的相对亲和力。结果表明，与天然酶相比，nanoMIP [Cyt c]对变性细胞色素c具有更大的亲和力（图4 A），与 K D值一致。此外，nanoMIP [Cyt c]与漆酶和脂肪酶的相互作用可以忽略不计。竞争性实验也验证了nanoMIP [laccase]和nanoMIP [lipase]的选择性（图4 B, C）。

图4.与变性细胞色素c、天然细胞色素c、变性漆酶、天然漆酶、变性脂肪酶和天然脂肪酶孵育后(A) FAM-nanoMIP[Cyt c]、(B) FAM-nanoMIP[laccase]和(C) FAM-nanoMIP[lipase]的荧光强度。天然、变性和回收的(D) 细胞色素c、(E) 漆酶和(F) 脂肪酶的圆二色谱。天然、变性和回收的(G) 细胞色素c、(H) 漆酶和(I) 脂肪酶的内源荧光光谱。ThT荧光法测定跟踪酶重折叠过程中的动力学（λex=445 nm，λem=485 nm），(J) 变性细胞色素c、(K) 变性漆酶和(L) 变性脂肪酶与nanoNIP和nanoMIP孵育一定时间后的荧光强度。

通过圆二色谱研究nanoMIPs促进变性酶再折叠的机制。在天然状态下，α-螺旋表现为208和222 nm左右的两个负峰。然而，在变性状态下，208和222 nm处的峰值强度显著降低，表明从α-螺旋向β-折叠构象的转变。与nanoNIPs孵育只能部分恢复二级结构，而与nanoMIPs孵育显著促进了变性酶的再折叠，使其水平接近于天然状态（图4 D– F）。蛋白质的变性通常会暴露内部的疏水残基，这导致蛋白质之间通过疏水相互作用形成聚集体，来自L-色氨酸等芳香族氨基酸的强度和最大波长（ l max）会发生变化，故荧光强度反映了酶结构的变化。使用荧光光谱法进一步对结构进行解析，变性细胞色素c的荧光由于构象的改变而显著降低，用nanoMIP [Cyt c]恢复的细胞色素c表现出与天然状态相似的强度，而nanoNIP仅促进部分重折叠（图4 G）。对于变性漆酶和脂肪酶也观察到类似的结果（图4 H, I）。硫黄素T（ThT）特异性检测由蛋白质错误折叠和聚集引起的β淀粉样纤维化，并在结合后表现出增强的荧光强度。ThT荧光测定追踪显示，与变性的细胞色素c结合后出现显著的荧光，与nanoMIP [Cyt c]共孵育期间荧光强度逐渐降低，表明变性酶量的减少。而与nanoNIP共孵育后荧光降低程度相对较小（图4 J）。对变性漆酶和脂肪酶的研究也得到了类似的结果（图4 K, L）。

图5.(A) 变性蛋白质和天然蛋白质的示意图。(B) 变性漆酶、(C) nanoNIP2复性后的漆酶、(D) nanoMIP[laccase]复性后的漆酶、(E) 天然漆酶的高分辨率透射电子显微镜(HRTEM)表征。(F) 变性漆酶、(G) nanoNIP2复性后的漆酶、(H) nanoMIP[laccase]复性后的漆酶、(I) 天然漆酶的负染色TEM图像。(J) 变性脂肪酶、(K) nanoNIP23复性后的脂肪酶、(L) nanoMIP[lipase]复性后的脂肪酶和(M) 天然脂肪酶的HRTEM表征。(N) 变性脂肪酶、(O) nanoNIP23复性后的脂肪酶、(P) nanoMIP[lipase]复性后的脂肪酶和(Q) 天然脂肪酶的负染色TEM图像。

为了从宏观角度验证构建的人工分子伴侣通过与酶的变性形式相互作用促进酶的重折叠，采用负染色透射电子显微镜（TEM）和高分辨率透射电子显微镜（HRTEM）来表征两种高分子量的酶：漆酶和脂肪酶（图5 A）。观察到变性漆酶和脂肪酶的聚集体（图5 B、 F、 J和 N），nanoNIP仅促进部分变性酶恢复到天然状态（图5 C、 G、 K和 O），而nanoMIP显著降低了聚集体的丰度，并使酶更接近其天然形式（图5 D、 E、 H、 I、 L、 M、 P和 Q）。TEM的结果直观地证实了研究者设计的人工分子伴侣通过减少不溶性蛋白并介导酶更接近其天然构象。

北京化工大学博士研究生/韩国科学技术院访问学生李燕，作为该论文的第一作者，北京化工大学的吕永琴教授和韩国科学技术院的Sang Yup Lee教授为该论文的共同通讯作者。该研究获得国家重点研发计划（2022YFC2105900）、国家自然科学基金（22122801、U22A20426）、中央高校基本科研业务费（QNTD2023-01）、中国国家留学基金委（202206880018）、韩国科学技术和信息通信部支持的下一代生物精细化工平台技术发展项目（2022M3J5A1056072）、以及韩国科学技术和信息通信部支持的微生物细胞工厂平台技术发展项目（2022M3J5A1056117）的支持。

参考文献：

Yan Li, Deping Yin, Sang Yup Lee*, Yongqin Lv* ，Engineered polymer nanoparticles as artificial chaperones facilitating the selective refolding of denatured enzymes，PNAS, 2024, 121 (19) e2403049121 DOI: 10.1073/pnas.2403049121

作者介绍：

吕永琴，北京化工大学教授，博士生导师，国家优秀青年基金获得者，担任北京市生物加工过程重点实验室副主任。2005年毕业于北京化工大学材料科学与工程学院，获学士学位；2010年12月获北京化工大学化学工程与技术专业博士学位，师从谭天伟院士；2008年11月至2010年2月，获国家留学基金委资助，作为联合培养博士研究生，在澳大利亚联邦科学与工业研究组织（CSIRO）材料科学系学习交流；2011年1月至2012年12月，在美国加州大学伯克利分校化学系和劳伦斯国家实验室从事博士后研究工作。2013年1月以“人才引进”受聘于北京化工大学生命科学与技术学院。获侯德榜化工科学技术奖青年奖、教育部自然科学奖二等奖、石油化工联合会技术发明奖一等奖等奖项。主要从事限域微环境调控促进生物催化、光/电驱动生物催化固碳及仿生抗体工程等相关研究。在PNAS、J. Am. Chem. Soc.、Matter 、Nano Lett.、Adv. Sci.、Prog. Energ. Combust.、Biotechnol. Adv.等期刊发表第一或通讯作者SCI论文60余篇；申请发明专利二十余项，获授权11项；主持科研项目10余项，其中国家级项目9项。担任Biotechnology Advances客座编辑、Frontiers of Chemical Science & Engineering青年编委和客座编辑、Microchimica Acta编委、Bioresources and Bioprocessing青年编委、Synthetic and Systems Biotechnology编委和客座编辑、Biotechnology Notes编委、《生物加工过程》编委。

来源：高分子科学前沿

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