重医谢国明教授：DNA检测新策略，探索癌症早筛密码

在我们的身体里，核酸携带着生命的设计图——遗传信息，它们在细胞乃至整个生物体中调控着遗传信息的表达。

你知道吗？基因序列中的微小变化，即单核苷酸变异（SNVs），是多种癌症的关键驱动因素，也是精准医疗的重要标记物。例如，KRAS、EGFR和IDH1基因的突变在结直肠癌、肺癌和胶质母细胞瘤的诊断中起着至关重要的作用。

目前，荧光探针在特定、高分辨率和快速检测SNVs方面展现出巨大潜力。然而，传统的PCR检测方法需要将DNA从双链转变为单链，这一过程不仅复杂，还可能导致关键信息的丢失。

近日，重庆医科大学检验医学院谢国明教授团队提出了两种策略富集活性双链DNA，包括基于阻碍基团和可切割单元的PCR，并直接用于检测活性双链DNA中的SNVs。这一方法避免了传统PCR后处理步骤的复杂性和信息丢失风险，能够实现低至0.1%的变异等位基因频率（VAF）的检测。该研究发表在ACS Nano（IF:17.1）。

01

阻碍基团介导的链置换反应

研究发现，阻碍基团（RNA、C3、SS）能够阻碍链置换反应（SDR）的发生。在单链输入和双链输入（指带有单链突出的双链DNA）中引入阻碍基团，发现阻碍基团的存在并不影响toehold结合和分支迁移过程，但可能影响分支迁移的启动。在toehold结合后，分支迁移过程需要跨越阻碍基团才能继续进行。

此外，单链输入中即使存在阻碍基团也能触发SDR，但双链输入中这些基团会导致反应速率下降。温度升高可以提高反应速率，因为分子碰撞增加，有助于碱基对的打开。实验还发现，阻碍基团介导的SDR具有较高的特异性，且在较低温度下特异性更高。而且，toehold的长度对SDR速率有显著影响，较短的toehold会导致反应速率下降。C3和SS介导的SDR相比RNA介导的SDR需要更长的toehold来达到相同速率和产量，且SS形成的间隙更难穿越。这些发现有助于理解阻碍基团在SDR中的作用，以及如何通过调整toehold长度来优化反应效率。

02

可切割单元介导的SDR

对于可切割单元，研究人员选择了dU和切口酶识别序列进行概念验证。通过在双链探针的一侧修饰dU或引入切口酶识别序列以进行切割酶处理，另一侧则标记荧光基团和猝灭基团，从而可以轻松实时监测SDR过程。实验中观察到荧光信号的增加，并通过PAGE成功验证了酶消化和SDR的过程。随后，作者测试了它们在不同温度下检测三个位置突变的特异性。结果都表明，即使在没有热力学微调的情况下，修饰单元介导的dsSDR在区分SNVs方面表现更佳。

03

与PCR的兼容性和灵敏度

在确认了修饰单元对SDR的影响后，进一步将修饰单元嵌入引物中，构建了修饰单元介导的PCR（MU-PCR）。使用MU-PCR进行目标扩增和直接荧光信号监测。具体而言，在普通引物中修饰可切割单元或阻碍基团，然后进行标准的PCR扩增程序。当存在可切割单元时，修饰单元不会阻碍聚合酶延伸，允许常规PCR扩增。扩增后，使用尿嘧啶-DNA糖基化酶（UDG）消化dU碱基或切口酶消化识别序列，暴露出toehold区域并产生活性双链产物。在阻碍基团存在的情况下，聚合酶无法发挥作用，导致扩增在toehold区域终止。

两种策略中，修饰基团都设置在引物的非目标结合区域，其序列与目标序列无关。因此，PCR后生成的toehold区域的长度和序列可以自由控制。在对关键参数进行了优化后，将其用于突变丰度的检测，结果显示即使初始模板混合物中仅存在0.1%的目标等位基因，仍然可以观察到荧光信号。

04

KRAS突变的正交性检测

KRAS突变在人类癌症中很常见，如结直肠癌、胰腺癌和肺癌。此外，KRAS突变的存在可能会显著降低治疗的有效性。因此，准确诊断KRAS突变可以帮助为患者提供个性化的抗癌治疗。为了展示所提方法在更复杂序列环境中的适用性，该研究选择了KRAS基因作为模型基因。

首先，研究人员合成了KRAS突变型和野生型的质粒。通过MU-PCR扩增循环质粒，野生型和突变型DNA都产生了toehold位点。PCR产物通过Sanger测序验证。随后，使用标记的探针进行正交检测，以确认突变类型。结果表明，通过三种不同的引物介导的PCR和随后的dsSDR可以准确识别突变类型，并显示出良好的正交性，与Sanger测序结果一致。

05

临床应用探究

在证明了所提方法在质粒样本中检测KRAS SNVs的正交性后，该研究进一步探讨其在实际临床检测的实用性。研究人员收集了45名接受结直肠癌手术的患者的结直肠癌组织标本，提取的基因组DNA（gDNA）。提取后的gDNA浓度约为100-400 ng/μL，适合后续PCR。通过MU-PCR富集后，生成了有或没有酶切的活性双链产物。使用六种探针分析反应产物，以识别突变类型。

结果该方法在45个肿瘤组织样本中鉴定出31个KRAS阳性样本和14个阴性样本。所有样本同时使用标准Sanger测序进行验证。突变型的归一化荧光值显著高于野生型。受试者工作特征曲线（ROC）曲线下的面积（AUC）为0.99。与Sanger测序相比，临床灵敏度和特异性分别为94%和100%。这些结果均强调了该方法在真实临床场景中的潜在应用性和可行性。

通过这种方法，研究人员能够在活性双链DNA中直接检测到低至0.1%的基因突变，这对于早期发现和治疗癌症具有重要意义。此外，这种新方法的建立，不仅提高了检测的精确度，还为纳米科学领域提供了新的技术路径，未来有望应用于分子电路、基因分型和疾病诊断等多个领域，为我们更深入地理解生命科学打开了新的窗口。

文章链接：

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsnano.4c01511

专家简介

谢国明 教授

重庆医科大学临床检验诊断学教育部重点实验室副主任，医学检验微流控与SPRi重庆市工程中心学术带头人，重庆医科大学特聘教授，博士生导师、博士后合作导师。University of Nevada, Las Vegas和University of Illinois at Urbana-Champaign访问学者。

国家科技奖评审专家，国家自然科学基金评审专家，国家科技部重大专项评审专家，重庆市科技项目评审专家，国家教育部学位论文评审专家，重庆市体外诊断技术创新战略联盟第一届专家委员会副主任委员，重庆医科大学教育发展基金会理事。《分析仪器》杂志编委，Biosens.Bioelectron.X杂志客座编辑。

研究方向：临床分子检验与DNA动态纳米技术、液体活检与微流控芯片、POCT与生物传感器研究与开发。近5年主持2022年国家重点研发计划课题1项、2019年、2021年和2023年国家自然科学基金面上项目3项，2018年和2021年重庆市科技项目2项。在Nucleic Acids Research、Journal of the American Chemical Society、ACS Nano、Nano Letters、Small、Analytical Chemistry和Chemical Communications等杂志上发表SCI收录论文50余篇。获得2021年“四川省科学技术进步三等奖”1项。

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编辑：唐强虎 审校：方琪、谢国明