脑声问答（29）期丨浅析大小鼠条件性恐惧实验的测试方法（供参考）

动物和分组

选取出生后1w健康、雄性ICR小鼠28只，SPF级，体重(4±0.4)g，饲养条件为维持正常光照强度和光周期，室温19～25℃，相对湿度40%～60%，日温差小于4℃，环境噪声不超过60dB。将实验动物随机分为对照组和建模组两组，每组各14只。从出生后1w开始对建模组小鼠每日行胡须修剪操作1次，具体为将小鼠从笼中取出，剪短其胡须并维持至0.5mm，整个过程无麻醉，建模过程一直持续至出生后30d。建模过程中须将小鼠从鼠笼中取出并伴有抓拿动作，为排除抓拿刺激对实验结果的影响，在建模的同一时间段将对照组小鼠也从笼中取中，用与建模组同样的抓拿动作。

主要仪器

条件性恐惧设备箱采用视频追踪分析原理和技术，通过近红外视频摄像头实时视频记录(30帧/秒)，拍摄连续图像以区分细微动作，比较判断动物的活动状态，并自动采集行为数据，分析动物僵直(Freezing)或活动行为，其中僵直行为的判定条件为动物以呼吸活动为主、几乎无其它活动的僵立静止状态，同时运动指数必须保持在指数阈值的最小时间范围。通过动物行为学专业软件预先设定数据采集过程并记录每次实验阶段内小鼠在实验箱中的僵直时间，通过自带的软件对数据做进一步处理，计算僵直时间百分比等。设备箱包括实验箱A和B，实验箱A由内箱(35cm×35cm×45cm)和外箱组成，内箱无顶盖，四壁均为黑色不透明有机玻璃，底部安装有20根间距为3mm的铜棒(直径0.3cm)，对小鼠足底施加电击刺激，外箱隔音，顶部发生器提供声音刺激，后方换气扇维持恒定背景噪声(65dB)，每只小鼠实验前均用75%酒精清洁内箱环境;实验箱B内箱四壁为浅色有机玻璃，底壁为黑色不透明塑料，箱内照明处于关闭状态。小鼠自发活动箱采用16宫格式，活动箱顶部提供10W白炽照明，后部产生45dB背景噪声，活动箱四壁和顶部均为黑色不透明玻璃，底壁被划分为4×4的方格，顶部置有小鼠自发活动跟踪和采集系统。

- 条件性恐惧实验系统，型号：XR-XC404，上海欣软 -

声音条件性恐惧建立

和消退实验程序

造模成功后，进行声音条件性恐惧建立和消退实验。第一天为适应阶段，将小鼠顺次放入实验箱A和B中各20min，使其充分适应实验环境。24h后进入恐惧条件化阶段，将小鼠放入实验箱A内适应2min，然后给予声音刺激(强度60dB，持续20s)，同时行联合足底电击(电流强度0.7mA，持续0.5s)。声音与足底电击联合训练共进行6次，每次联合训练作为一个Test，每两次训练间隔平均120s。6次训练全部结束后1min将小鼠从实验箱A中取出。恐惧条件化阶段结束后24h进行恐惧消退程序，将小鼠放入实验箱B内适应2min，然后单独给予与恐惧条件化相同的声音刺激，不进行联合足底电击。声音刺激共呈现12次，每次训练作为一个Test，相邻两次作为一个Test block，每两次训练间隔平均120s。训练结束后1min将小鼠从实验箱B中取出。恐惧消退程序结束后24h进行恐惧消退再现检测阶段，将小鼠放入实验箱B中适应2min，单独呈现共12次声音刺激，无足底电击，每两次训练间隔平均120s。训练结束后1min将小鼠从实验箱B中取出。小鼠的行为表现由置于实验箱上方的录像设备全程监控并记录，生成的数据由相应软件进行处理和分析。

场景条件性恐惧建立和

消退实验程序

触觉阻断后，对小鼠进行场景条件性恐惧建立和消退实验。第一天为环境适应阶段，将小鼠顺次放入实验箱A中20min，无任何刺激，使其充分适应实验箱的场景。24h后进行场景条件性恐惧的建立，先将小鼠放入实验箱A内适应2min，然后开始对其足底进行电击(电流强度0.7mA，持续0.5s)，相同足底电击共进行7次，以两次电击间隔为一个Test，共6个Test，两次电击间隔时间平均为120s，训练全部结束后1min将小鼠从实验箱A中取出。恐惧条件化阶段结束后24h进行恐惧消退程序，将小鼠置于实验箱A内18min，无任何刺激，期间以每3min作为一个Test block，结束后将小鼠从实验箱A中取出。恐惧消退程序结束后24h进入消退记忆再现检测阶段，检测过程同恐惧消退程序。小鼠的行为表现由置于实验箱上方的录像设备全程监控并记录，生成的数据由相应软件进行处理和分析。

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非特异性僵直行为检测

以上两个实验中声音和场景这两种刺激均会使小鼠产生非特异性的僵直行为，而对建模组小鼠的触觉阻断可能会对这种非特异性僵直行为产生影响，所以需要检测触觉阻断对声音和场景条件刺激下小鼠非特异性僵直百分比的影响程度。声音条件性非特异性僵直行为检测分三个步骤，首先将小鼠放入实验箱A中，适应15min后放回鼠笼;24h后再将小鼠置于实验箱A中，呈现两次声音刺激(强度60dB，持续20s)，中间间隔60s，无电击等其它刺激，结束后放回鼠笼;24h后再重复进行以上操作一次。场景条件性非特异性僵直行为检测分两个步骤，首先将小鼠放入实验箱A中，不呈现任何刺激(声音、电击等)，15min后放回鼠笼;24h后再重复进行以上操作一次。小鼠僵直行为由置于实验箱上方的录像设备全程监控并记录，生成的数据由相应软件进行处理和分析。

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自发性活动检测程序

对触觉的阻断可能会影响小鼠的自发性活动，从而影响声音条件性和场景条件性恐惧建立和消退过程中小鼠的僵直百分比。为了评估触觉阻断对小鼠自发活动的影响，需要进行小鼠自发活动的检测。先将小鼠置于自发活动箱内适应20min，24h后，再将小鼠置于自发活动箱内15min，用自发活动跟踪系统检测小鼠在此期间内穿越格子的数量，24h后再重复进行以上操作一次。

观察指标

僵直(Freezing)是小鼠等啮齿类动物受到威胁性或伤害性刺激时的一种应激反应，具有特异性，表现为以呼吸活动为主、几乎无其它活动的僵立静止状态。用事先设定的程序记录每次实验阶段内小鼠在实验箱中的僵直时间，计算僵直时间百分比。

文献引用：

1.米非司酮对大鼠恐惧条件化及消退的影响[J]. 付娟;田绍文;马原野.中国应用生理学杂志,2014(04)

2.Prazosin during fear conditioning facilitates subsequent extinction in male C57Bl/6N mice.[J]. Lucas Elizabeth K;;Wu Wan-Chen;;Roman-Ortiz Ciorana;;Clem Roger L.Psychopharmacology,2019

3.Fear Extinction Requires Reward[J]. Sheena A. Josselyn;;Paul W. Frankland.Cell,2018

4.刘冬播,石彦,陈传好,等.触觉阻断对小鼠声音和场景条件性恐惧建立和消退的影响[J].齐齐哈尔医学院学报,2021,42(08):652-658.

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