北大团队发现类病毒颗粒新机制，助力研发新型疫苗

‍“本次成果对于疫苗开发具有重要意义。与普遍使用的减毒活疫苗或灭活疫苗相比，基于类病毒颗粒的疫苗除了具有更高的安全性和更易制造等优势外，还能容纳更多的抗原，因此有望提供更强的治疗效力。”北京大学未来技术学院研究员陈匡时表示。

图 | 陈匡时（来源：陈匡时）

近日，他和团队发现 Gag 的组装密度，能够影响细胞膜蛋白在病毒膜上的招募。Gag 组装密度越高，膜蛋白在病毒膜上的富集程度越低。

相比病毒颗粒的 Gag 组装，类病毒颗粒更加松散，因此能容纳更多的抗原，从而有望带来更强的治疗效力。

此外，类病毒颗粒与普遍使用的减毒活疫苗和灭活疫苗相比，由于类病毒颗粒不携带病毒基因组，因此具有更高的安全性、也更容易制造。

针对病毒颗粒和类病毒颗粒不同组装机制的研究、及其调控后续膜蛋白的招募的发现，有助于发展基于类病毒颗粒的疫苗平台。

Gag 蛋白，是 HIV-1 病毒、以及其它逆转录病毒的结构蛋白。Gag 蛋白亦是一种多功能蛋白，具有多个结构域。

这些结构域分别是：与细胞膜互作的 Matrix结构域、与自身互作的 Capsid 结构域、与 RNA 互作的 nucleocapsid 结构域、以及负责病毒释放的 p6 结构域。

HIV-1 病毒颗粒的组装，是数千个病毒结构蛋白 Gag 与二聚化病毒基因组 RNA（gRNA）在细胞膜上广泛相互作用的结果。

仅有一小部分（几十个）Gag 可以与 gRNA 上的一小段特殊序列（即包装信号 Ψ）发生特异相互作用，从而介导病毒对于 gRNA 的精准包装。

而绝大多数 Gag 则与 gRNA 的其余部分发生非特异（静电）相互作用，利用 gRNA 作为长链支架，在促进 Gag 多聚化的同时还能包装 gRNA。

因此，Gag 除能与 gRNA 相互作用之外，已被证实还能与多种 RNA 比如 mRNA、microRNA、甚至人工合成的寡核苷酸结合。

有趣的是，在被 HIV 感染的细胞中，即当 gRNA 存在时，尽管 gRNA 的数量远小于细胞自身的 mRNA。但是，大约有 90% 被释放出来的颗粒中带有 gRNA。

在没有 gRNA 存在的情况下，即当 Gag 被单独表达时，Gag 可以随机地与多条不同的细胞 mRNA 相互作用并发生多聚化，最终形成不具备感染性、但是形态正常的颗粒——类病毒颗粒（virus-like particle，VLP）。

据介绍，为何 Gag 能够在复杂的细胞环境中高效地挑选出病毒 RNA 并利用其进行高效地多聚化，一直是领域内的关键生物学问题。

而 Gag 与病毒包装信号 Ψ 的相互作用，被认为是 Gag在 众多细胞 mRNA 的存在下，仍然能够高效包装病毒 RNA 的重要原因。

然而，Gag 包装 gRNA 和细胞 mRNA，是否是通过相似的多聚化途径？针对此，学界依然不甚明确。

而了解这两种组装过程，对于 RNA 病毒学基础研究、RNA 药物开发、甚至对于基于灭活病毒和假病毒疫苗的研发具有重要意义。

目前，对于 Gag 在细胞膜上组装的研究，主要是通过生化手段实现。然而，这些手段依赖细胞裂解，因此无法对组装过程进行原位、实时、动态探究。

基于荧光显微成像技术可以弥补这一不足。但是，现阶段的研究主要通过能在活细胞中对目标分子成像的宽场显微技术。

这种技术受限于 250nm 的衍射极限，因此仍然无法深入探究直径仅约为 150nm 的病毒颗粒的具体组装过程。

这些技术问题导致现阶段的研究普遍认为：Gag 能够精准包装病毒 RNA，是因为 Gag-Ψ 的相互作用，形成了一种能够驱动组装的成核位点。

而大多数 Gag 所参与的后续 gRNA 组装过程，和 Gag 与细胞 mRNA 互作的组装过程没有区别。

陈匡时的研究方向是 RNA 纳米生物技术与单分子成像及其在 RNA 病毒生物学中的应用。

在过去的十多年里，他重点围绕发展新型成像技术来研究 RNA 在 HIV-1 病毒组装中所扮演的角色。

期间，他主要利用的技术是单分子定位显微技术（Single molecular localization microscopy，SMLM），该技术可以在 20nm 的空间尺度下，针对特定分子进行精准定位。

比如，他曾利用 SMLM 技术阐明了 Gag 与 gRNA 组装的完整过程，发现了 microRNA 能与病毒 RNA、以及与细胞 mRNA 竞争结合 Gag。

从而对 Gag 组装过程进行干预，也开发了可以干扰病毒组装的 RNA 自组装纳米材料。

这些工作为利用 SMLM 技术解析病毒颗粒和类病毒颗粒的组装模式奠定了基础。

于是，他提出了利用 SMLM 区分 Gag 利用病毒 RNA 和细胞 mRNA 进行组装的想法。

为了验证可行性，他和团队构建了可以在细胞中同时表达荧光标记的 Gag 和病毒 RNA、以及仅能表达 Gag 的质粒。

通过分别在细胞中表达这两种质粒，并且验证它们能够正常地在细胞中组装并被释放之后，课题组进一步地利用 SMLM 技术，研究 Gag 在上述两种实验条件下的组装行为。

具体来说，他们观察了细胞膜上不同大小的 Gag 多聚体，并对每个多聚体的密度进行分析，从而获得组装密度与组装平台大小的关系。

实验结果表明：在包装病毒 RNA 的时候，Gag 的组装更紧密，且极大地依赖 Gag 与 Gag 之间的互作、以及 Gag 与 RNA 的互作。

相反的，在包装细胞 RNA 的时候，会形成更多的组装平台。但是，Gag 在每个平台中的组装比较松散，其密度不随着组装平台的增长而增加，这说明被包装的多个随机的 mRNA，无法有效地协同促进 Gag 的组装。

（来源：Science Advances）

通过时间相关系数光激活定位显微技术（tc-PALM）、 HMM-Bayes 等分析方法，他们针对单分子 Gag 的运动轨迹、频率等参数进行分析，进一步发现 Gag 在包装细胞 mRNA 时更加不稳定。

（来源：Science Advances）

基于这些结果，课题组提出这样一个组装模型：当 Gag 包装以二聚体形式存在的 gRNA（长度约 18kb）时，gRNA 可作为长链的支架招募所有的 Gag 蛋白，协同驱动 Gag 蛋白发生多聚化从而形成紧密的聚落。

当 Gag 包装多条、相对较短的细胞 mRNA 时，Gag 会分别在不同的 mRNA 上，以多聚化的方式形成较小、且相对零散的聚落。尽管组装平台最终还是能够形成，但是该平台的紧密程度低于包装病毒 RNA 的 Gag 组装平台。

随后，他们还证明这两种组装差异，对于 HIV 膜成分具有一定影响。

（来源：Science Advances）

目前已有大量证据表明：Gag 多聚化能够积极重塑质膜结构，形成一种独特的 HIV 膜，使其呈现出液态有序的结构，其中富含胆固醇和磷脂酰肌醇 4，5-双磷酸酯[PI（4，5）P2]等。

此外，亦有其他课题组的研究表明：Gag 多聚化介导的脂质重组也可能作为一种驱动力，从而帮助选择性地招募对有序脂质环境具有亲和力的特定质膜蛋白。

但是，包装不同 RNA 是否会影响 HIV 膜上选择性脂质和蛋白质分选过程，针对这一问题此前尚未有人探索。

基于 Gag 包装病毒 RNA 时 Gag 的密度较高，因此该团队推测这样的组装环境，可能具有空间位阻效应，因此在一定程度上抑制了病毒对于其他蛋白的招募。

通过显微成像，课题组证实：两种组装模式对于细胞膜的重塑有类似的效果。但是，在包装细胞 mRNA 的 Gag 组装平台中，跨膜蛋白比如 MLV-Env 的富集水平更高。

基于此，他们提出这一概念：通过介导 Gag 组装的紧密程度，被包装的 RNA 能够调控 HIV 膜的蛋白组分。

最终，相关论文以《RNA 支架在 Gag 纳米多聚化和 HIV 病毒膜选择性蛋白筛选中的作用》（Roles of RNA scaffolding in nanoscale Gag multimerization and selective protein sorting at HIV membranes）为题发在 Science Advances[1]。

应亚宸是一作，杨艳涛是二作，陈匡时担任通讯作者。

图 | 相关论文（来源：Science Advances）

陈匡时表示：“本次论文顺利发表离不开实验室成员的努力。担任第一作者的博士生应亚宸展现了出色的科研能力和毅力，基本独立完成本研究中所涉及的所有实验和数据分析。已于 2021 年毕业的杨艳涛博士曾参与建立实验室的超分辨率显微成像平台，为课题完成打下了重要基础。”

对于本次论文审稿人表示，通过精密的显微成像技术在纳米水平下，解析 Gag 包装 gRNA 和细胞 mRNA 具有不同组装模式的结果非常具有吸引力。

HIV Gag 在 gRNA 上，比在细胞 mRNA 上组装的效率更高， 形成的聚集体更密集，并且这些聚集体的形成具有协同效应。

这些发现回答了领域内一个尚未解决的问题：即为何病毒基因组需要以二聚体形式才能够被高效地包装。

此外，本次发现强有力地支持了前人基于生化和水溶液 Gag 组装实验所提出的假设，即 gRNA 比细胞 mRNA 能够更有效地驱动 Gag 组装。

最后，由于当前人们在研究颗粒的时候，往往不会专门区分病毒颗粒和类病毒颗粒，因此审稿人认为本次所发现的这两种颗粒的 Gag、以及包膜蛋白组分的差异是一个颠覆性发现。

如前所述，gRNA 是以二聚体形式被包装到病毒颗粒的，而 gRNA 二聚体是驱动病毒组装的条件。然而，gRNA 二聚体是在细胞中如何形成的，仍然是一个具有争议性的问题。

为回答这个问题，该团队计划发展可对 HIV gRNA 二聚体进行高效标记的成像技术，并通过将其与超分辨率成像技术相结合，深入研究 gRNA 二聚体的形成机制、及其在病毒组装中所扮演的角色。

另据悉，陈匡时发现 Gag 不但能够与天然 mRNA 互作，也能够与人工合成的寡核苷酸互作。

基于这些发现，课题组计划发展基于假病毒颗粒（类病毒颗粒）的 RNA 递送体系。

相比依赖化学合成的递送体系，基于蛋白的类病毒颗粒具有安全性更高、合成更容易、靶向可控性更好的优势。

而相比病毒颗粒，该团队发现类病毒颗粒的 Gag 组装平台更为松散。这使得更多的跨膜蛋白由于空间位阻较低的原因，能够被招募到类病毒颗粒膜。

这一现象提示着：类病毒颗粒能够容纳更多的抗原。基于这一发现，他们计划发展一系列带有不同抗原的类病毒颗粒体系。

另据悉，陈匡时出生于中国台湾台北市，英文名为：ANTONY KUANG-SHIH CHEN，其中“KUANG-SHIH”为“匡时”的台湾拼音。

15 岁时，陈匡时赴美留学，先后在美国完成了高中、大学和研究生教育。

获得美国加州大学圣地亚哥分校的学士与硕士学位、美国宾夕法尼亚大学的博士学位。

随后，他分别在美国国家标准与技术研究院和美国国立卫生研究院完成博士后研究。

2013 年，陈匡时回国加入北京大学担任研究员，目前主要研究 RNA 纳米技术、单分子成像和 HIV-1 组装生物学。

参考资料：

1.Ying Y., Yang Y.,Chen A.K.*Roles of RNA scaffolding in nanoscale Gag multimerization and selective protein sorting at HIV membranes. Sci. Adv. 2024,10(8):eadk8297.

2.Qu, N., Ying, Y., Qin, J., andChen, A.K.*Rational design of self-assembled RNA nanostructures for HIV-1 virus assembly blockade. Nucleic Acids Res. 50(8):e44.(2022)

3.Mao, S., Ying, Y., Zhao, M., Yang, Y., andChen, A.K.*A Background Assessable and CorrectableBimolecular Fluorescence Complementation System for Nanoscopic Single-Molecule Imaging ofIntracellular Protein-Protein Interactions.ACS Nano.15, 14338-14346. (2021)

4.Yang, Y., Qu, N., Tan, J., Rushdi, M.N., Krueger, C.J. andChen, A.K.*Roles of Gag-RNA interactions in HIV-1 virus assembly deciphered by single-molecule localization microscopy.Proc Natl Acad Sci U S A.,115, 6721-6726. (2018)

5.Qu, N., Ma, Z., Zhang, M., Rushdi, M.N., Krueger, C.J. andChen, A.K.*Inhibition of retroviral Gag assembly by non-silencing miRNAs promotes autophagic viral degradation.Protein & Cell, 9, 640-651. (2018)

6.Pak A.J., Grime J.M.A., Sengupta P.,Chen, A.K., Durumeric A.E.P., Srivastava A., Yeager M., Briggs J.A.G., Lippincott-Schwartz J., Voth G.A.* Immature HIV-1 lattice assembly dynamics are regulated by scaffolding from nucleic acid and the plasma membrane.Proc Natl Acad Sci U S A.,114, E10056-E10065. (2017)

7.Chen, A.K., Sengupta, P., Waki, K., Van Engelenburg, S., Ochiya, T., Ablan, S.D., Freed, E.O. and Lippincott-Schwartz, J.* MicroRNA binding to the HIV-1 Gag protein inhibits Gag assembly and virus production.Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 111(26):E2676-83. (2014)

运营/排版：何晨龙

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