广东
细胞培养是个看似简单，实则很费心力的工作，今天我们来捋捋这其中的细节，事无巨细那种的，欢迎大家一起交流讨论。
一、SKOV3细胞特点
SK-OV-3 (人卵巢癌细胞) (STR鉴定正确), 细胞简称：SK-OV-3 种属来源：人, 细胞形态：贴壁，上皮细胞样，McCoy's 5A＋10% FBS＋1% P/S 传代比例：1:2-1:4，每2-3天换液一次。
传代周期：48-72 h, 培养条件：气相： 5%CO2，温度：37℃，冻存条件：55%基础培养基+40%FBS+5%DMSO，液氮储存。
二、细胞复苏（原则 缓冻速溶）：
1、准备37℃水浴；
2、从液氮中取出细胞；
3、迅速置37℃水浴，1min内融化；
4、打开培养基瓶盖（开盖前酒精棉擦拭盖口边缘），培养基瓶放在瓶架上，瓶盖放在“非工作区”，以免工作时污染；
5、摇出或用取物钳（用前酒精棉擦拭）取出移液管（头部不能接触任何物品）；
6、用移液管向培养皿（瓶）中加10ml新鲜培养基；
7、摇出或用取物钳（用前酒精棉擦拭）取出吸管，安上吸头，插入灭菌离心管中（吸管头部不能接触任何物品）；
8、用酒精棉擦拭冻存管；
9、开盖，将管内液吸入含10ml新鲜培养基的培养皿（瓶），摇匀。
10、放入CO2培养箱培养，24h后换液。
三、贴壁细胞的传代培养：
1、打开培养皿（瓶）盖（盖放在“非工作区”， 盖、培养皿口不能接触任何物品），倾斜吸出（可用真空泵）所有的培养基；
2、加入2ml PBS洗涤，倾斜吸出PBS；
3、加入0.5ml-1ml胰酶溶液，混匀，倾斜吸出多余胰酶，不必吸干；
4、37℃消化1-2min左右，显微镜下细胞变圆。倾斜培养皿看到少量细胞自由流动即可；
5、用吸管加入约4ml完全培养基，用吸管将细胞吹打下来；
6、将细胞悬液分配至新的培养瓶（皿）中，再用移液管加入8ml新鲜的培养基，盖盖。
7、收培养基瓶，盖盖；
8、收离心管，吸管，冲洗；
9、75％酒精擦台面，冲洗废液缸；
10、关闭超净工作台。
四、冻存：
1、接贴壁细胞的传代培养中第4步（避免消化时间过长，否则会影响冻存质量）；
2、用移液管加2ml冻存液，用吸管将细胞吹打下来；
3、移入2ml冻存管（1ml/管），标记冻存管；
4、置于液氮液面上；
5、12－24h后放入液氮，记录。
另：
完全培养基：基础培养基＋胎牛血清10％＋双抗溶液1％
胰酶溶液：0.25％胰酶＋0.02％EDTA-Na2
冻存液：55%胎牛血清+40%基础培养基+5%DMSO
注：
无菌操作的关键是有可能接触细胞的任何物品不能接触到为灭菌的物品。
有条件的直接全部一次性。后面一段可以略过。
比较节约的可以参考如下操作，严格来操作的，养细胞也是没有问题的。
胶头滴管和移液管清洗步骤：
1、将滴管（移液管）用尼龙绳捆扎成一捆,每捆约20-30根，捆紧，要求捆起后不会有滴管（移液管）滑出。
2、放入酸缸泡大于6小时，一般为过夜。
3、从酸缸中捞起（戴防酸手套），沥干酸液。
4、自来水冲洗滴管至没有黄色后，再用流水冲洗至少10遍，需将酸液完全冲净，残留酸液会影响细胞生长。
5、去离子水冲洗3遍，每次冲洗均换水。
6、放入烘箱烘干。
7、从烘箱中取出，滴管（移液管）上边塞入棉花，不能太紧，以免滴管不好用；也不能太松，以免将棉花吹落。
8、将塞好棉花的滴管（移液管）放入不锈钢杯中，高压灭菌。
9、高压灭菌结束，将不锈钢杯放入烘箱烘干。
10、从烘箱中取出，一般是备用。
注意事项：
1 培养细胞前，务必查下细胞的培养条件，是需要什么样的基础培养基，除了加FBS，还要不要加胰岛素，非必须氨基酸等等。
2 保种用的耗材尽量用无菌一次性的，毕竟细胞种子比较珍贵。
3 细胞培养注意要点
➊ SK-OV-3细胞对肿瘤坏死因子和几种细胞毒性药物包括白喉毒素、顺铂和阿霉素均耐受。
➋ 在免疫抑制小鼠中致瘤，可形成与卵巢原位癌一致的中度分化腺癌。
来源：环凯转载于“ 细胞铲屎官”公众号；作者~小曼，内容版权归原作者所有。
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