刘如谦团队开发噬菌体辅助的分子胶复合物连续进化系统

撰文 | Qi

分子胶（molecular glues, MG）是一种能通过增强蛋白间相互作用来调控相关生物过程的小分子。免疫调节药物（immunomodulatory drugs, IMiDs）沙利度胺及其类似物泊马度胺和来那度胺就是一类能结合CRBN（CRL4CRBN E3泛素连接酶的底物受体）的分子胶，可诱导其与底物的空间邻近，进而导致底物蛋白被泛素化和降解【1-3】。研究表明IMiDs-CRBN可识别含锌指结构域（ZF）的转录因子中常见的小β转角（β-turn）基序，将其添加至其他蛋白上，使所得融合蛋白更易受到IMiD诱导的降解【4, 5】。在没有CRBN的情况下，IMiDs不会与蛋白底物形成无效的二元复合物，即不会表现出“构型效应”特征【6, 7】。

常见的小分子诱导蛋白靶向技术包括dTAG系统、SMASh、HaloPROTACS以及生长素诱导的蛋白降解子（degron）系统【8-11】，但这些蛋白标签受限于较大的尺寸（108至304个氨基酸），主要用于融合蛋白的外源表达研究。相比之下，IMiD结合的CRBN识别的一些ZF基序足够小，理论上可以使用先导编辑（prime editing）精确插入到目标基因框中，但已有研究表明IMiD具有显著的脱靶降解效应，限制了其作为靶点特异性调节剂的研究用途【12, 13】。

为了解决这一问题，来自美国麻省理工学院-哈佛大学布罗德研究所的刘如谦（David R. Liu）团队等在Science杂志上合作发表了一篇题为Continuous evolution of compact protein degradation tags regulated by selective molecular glues的文章，他们开发了一个噬菌体辅助的分子胶复合物连续进化系统（MG-PACE），并利用该系统进化出由36个氨基酸组成的ZF蛋白降解子（SD40），小尺寸有利于先导编辑将其插入内源蛋白编码基因中，且能介导人类细胞中标记蛋白的有效降解并无伴随脱靶效应，高分辨率冷冻电镜结果揭示了SD40活性及特异性的结构基础。总之，这项工作不仅构建了一个用于分子胶复合物快速重塑的连续进化平台，还克服了现有降解子的明显脱靶弊端。

PACE系统利用M13噬菌体极短的生命周期（约10分钟），以最小干预实现蛋白质分子的多代进化。简而言之，该系统主要包含3个模块，噬菌体模块（SP）中编码噬菌体外壳蛋白pIII的基因gIII被目标蛋白（待进化）基因所取代；大肠杆菌中含有的辅助质粒（AP）含gIII基因，但其表达与待进化目的基因的活性相关；以及诱变质粒（MP）负责增加噬菌体复制过程中的突变频率，最终结果是无突变或不能启动AP中gIII表达的噬菌体从体系中淘汰。

图1. MG-PAGE系统示意图。

基于此，该团队试图构建将pIII表达与分子胶三元复合物的形成相联系的MG-PACE系统。已知IMiD结合CRBN C末端结构域中的疏水口袋，将其戊二酰亚胺环置于口袋内，并使邻苯二甲酰亚胺环部分暴露，CRBN•IMiD新底物（neosubstrates）能与暴露的IMiD邻苯二甲酰亚胺环及周围的CRBN蛋白表面结合，为最大限度地减少脱靶蛋白降解，他们最近合成了一组在邻苯二甲酰亚胺4位和5位具有取代基的IMiD衍生物，以阻碍新底物结合，其中，PT-179不会诱导已知的泊马度胺新底物降解。分别用泊马度胺或PT-179处理含已鉴定IMiD新底物的多种人类细胞系后经蛋白组学和转录组学分析，仅观察到泊马度胺诱导的新底物IKZF1、ZFP91等的显著下调。

为进化出与PT-179-CRBN结合的ZF，他们选取由IMiD新底物IKZF1和ZFP91组成的含60个氨基酸的嵌合体作为起始ZF（SD0），将CRBN融合到DNA结合蛋白RR69，并将SD0融合到RNAP（RNA聚合酶）ω亚基，进而通过发光测定转录激活情况。经过多代进化和测试，他们在包含8个突变的SD36基础上，连续截断其对于CRBN·PT-179结合非必要的N/C端，得到一个仅包含36个氨基酸的最小降解子SD40，其对PT-179诱导的eGFP荧光报告蛋白（与SDn融合）降解效力增强了3.2倍，不仅如此，将SD40-eGFP分别于泊马度胺和PT-179共处理人类细胞系，前者会导致SD40-eGFP与多种已知的泊马度胺内源性新底物一起显着降解，而用 PT-179处理组，SD40-eGFP是唯一显着降解的蛋白质。SD40中的进化突变聚集在C端及IMiD接触位点附近，该团队随后通过高分辨率冷冻电镜分析SD40与PT-179或泊马度胺结合复合物结构，揭示其活性和特异性的分子基础。由于SD40仅包含36个氨基酸，该团队利用twinPE将其插入哺乳动物目标基因中，可用于评估其介导内源性靶蛋白降解的潜力。

图2. 噬菌体辅助下ZF的持续进化系统示意图。

与人类CRBN相比，小鼠CRBN（mmCRBN）包含可阻止IMiD诱导的ZF新底物招募的V388I突变，开发出与mmCRBN兼容且有效的降解子将有助于小鼠靶蛋白功能的研究。为此，他们构建了mmCRBN MG-PACE系统，利用SD36编码噬菌体进行了共205小时的PACE。为测试产生的degron是否有效，该团队用degron-eGFP-IRES-mCherry载体向小鼠3T3细胞中转导SD0、SD36和SD56。用PT-179处理过夜后，当与SD0融合时，没有观察到eGFP降解的迹象，但SD36和SD56引起了剂量依赖性eGFP降解，且SD56表现出比SD36更大的效力。

综上所述，这项工作提供了一种能重塑分子胶相互作用的强大工具MG-PACE，能以精确的特异性操纵人类和小鼠细胞中的蛋白质水平，对于研究蛋白质功能或验证潜在的治疗靶点来说具有重要价值。

原文链接：

https://doi.org/10.1126/science.adk4422

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