Jay Keasling团队构建合成生物学新工具包

粮食生产已被确定为气候变化的主要原因之一。占到全球温室气体排放量的三分之一，很大程度上造成了生物多样性减少和生态系统破坏。在 2023 年迪拜举行的第 28 届联合国气候变化大会上，联合国粮农组织宣布将启动一项突破性计划，旨在到 2050 年将世界农业和粮食系统从一个净排放部门转变为碳汇部门。

将粮食生产从资源密集型工业化畜牧业转向微生物加工等方法是应对气候变化非常可行的方法。与畜牧业相比，微生物生产可以提高资源效率和安全性，更精确地控制生产，减少动物痛苦，并降低环境足迹。

其中，真菌是一类极具商业化潜力的微生物细胞工厂，已被广泛应用于生产食品和高价值化学品。不过，当前作为底盘细胞的真菌主要以酵母这种单细胞真菌为主，多细胞真菌尚未大量用于构建工程化细胞工厂。

近日，加州大学伯克利分校（UCI）的研究团队为构建更复杂的细胞工厂提出了一种新方法。他们开发了一个模块化的合成生物学工具包用于工程化改造多细胞真菌米曲霉（Aspergillus oryzae），该工具包由用于基因整合的 CRISPR/Cas9、中性基因座和可调启动子等组成。结果显示，使用这些工具可以提高麦角硫因以及可食用生物质中决定风味和颜色的分子血红素在细胞内的表达水平。

（来源：Nature Communications）

本研究的通讯作者是加州大学伯克利分校生物工程系教授兼劳伦斯伯克利国家实验室高级研究员科学家Jay Keasling，他实验室的研究方向是开发细胞内代谢工程的基础工具，并利用这些工具解决重要的社会问题。实验室已经使用这些代谢工程工具生产抗疟药物青蒿素、各种商品、特种化学品以及生物燃料。

第一作者 Vayu Maini Rekdal 是在该实验室从事博士后研究，他是一名厨师出身的生物工程师，他正在结合微生物学、化学和美食学的背景理解和调控真菌基因，生产出更具风味、口感、可持续性的健康食品。

“这些发现凸显了合成生物学在增强真菌食品方面的潜力，并为食品生产及其他领域的应用提供了一套有用的基因工具。”

丝状真菌是一种关键的底盘细胞，基于基因工程方法使其可用于粮食生产，提高真菌食品的营养价值和口感。不过，领域内尚缺乏利用合成生物学工具改造可食用菌株生产食品的经验。在此背景下，研究团队针对米曲霉开发了一个模块化合成生物学工具包，并证明了其在增强真菌食品方面的效果。米曲霉是一种常用于发酵食品、蛋白质和肉类替代品的食用菌，几个世纪以来，东亚地区一直用它将淀粉发酵成清酒、酱油和味噌。

▲图 | 一种可循环的基于 RNP 的 CRISPR/Cas9 基因整合和表达方法（来源：上述论文）

合成生物学工具包涵盖了用于精确修饰基因的 CRISPR/Cas9 方法、用于靶向基因插入的中性基因座、可调启动子（包括双向启动子）、以及独立于培养基成分的合成表达系统。在研究中，该团队尝试开发一种可循环的 CRISPR-Cas9 方法，这种方法并非用质粒编码 Cas9 和 sgRNA，而是直接转化 CRISPR-Cas9 核糖核蛋白复合物（RNP）。通过评估，研究人员发现基于 RNP 的方法可以对米曲霉基因组进行一致、可重复修饰，且显示出与基于质粒方法相当的高效率和范围，更易于使用。

然后，采用计算方法来识别米曲霉中的候选中性基因座，并使用合成表达系统和双向启动子扩展启动子工具包。这些结果扩展了可用于工程化食用米曲霉基因调控工具和启动子的集合。

构建针对米曲霉合成生物学工具包之后，研究人员开始尝试通过对米曲霉进行生物工程改造生产更具有风味和营养价值的食品。首先，利用该工具包改造麦角硫因，发现内源基因 AO_Egt1 和 AO_Egt2 参与了在米曲霉中麦角硫因的生物合成，并验证了代谢工程方法改变真菌蛋白分子组成的可行性。

然后，该团队决定将类似的方法应用于生产更接近动物肉的可食用生物质。为了利用生物工程方法改善可食用生物质的风味成分和外观，团队的首要目标瞄准了生物合成血红素，这是高等生物体内红色含铁的携氧结合蛋白，可以使血液呈红色，并让肉类具有独特的味道。

▲图 | 生物工程方法改造米曲霉用于生产麦角硫因和血红素（来源：上述论文）

研究团队推断通过调节关键血红素生物合成酶的表达可以提高真菌生物质中血红素至肉类替代品中血红素的水平。他们设计了血红素生物合成途径，共涉及 8 种酶，并确定了共包含六个单独修饰的米曲霉工程菌株。

检测样品干重，结果显示，与非工程菌株相比，工程菌株的生物量中血红素含量高出 4倍，血红素水平是 IMPOSSIBLE Food 替代肉中血红素水平的 40%。研究人员还表示，这是真菌菌丝体中细胞内血红素含量最高的案例，在丝状真菌中血红素生物合成工程中也比较少见。

（来源：劳伦斯伯克利国家实验室官网）

此外，研究团队发现，血红素过量表达后，工程菌株的颜色呈现红色，而背景菌株（background strain）的颜色是灰白色。这些结果表明，与植物性肉类替代品相比，这种生物工程真菌蛋白无需大量加工即可轻松配制为肉饼，唯一需要处理的是在研磨和蒸煮之前从生物质中去除多余液体。烹饪后具有天然纹理、纤维的真菌生物质更增强了肉样外观，可煎成诱人的汉堡。

“通过开发这些合成生物学工具解锁曲霉菌，我们正在释放大量新宿主的潜力，我们可以用这些微生物制造食品、有价值的化学品、高能量生物燃料和药物。这是生物制造中一条令人兴奋的新途径。”Jay Keasling在新闻稿中说。

下一步，该实验室计划通过调整控制霉菌质地的基因，使真菌更具吸引力。一作 Vayu Maini Rekdal 指出，我们认为通过改变细胞的纤维状形态探索纹理有很大的空间，我们也许能够将纤维的结构编程得更长一些，从而提供更像肉的体验。然后，我们可以考虑提高脂质成分，进一步提高口感和营养。

素材来源官方媒体/网络新闻

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