江大团队实现两步法生物合成皮质类固醇

类固醇由复杂的环戊烷多氢菲结构组成，具有抗炎和免疫抑制作用，用于治疗各种临床疾病，包括急性感染、炎症后遗症、结缔组织自身免疫性疾病、COVID-19 和获得性免疫缺陷综合症（艾滋病）。

通常，为了实现类固醇理想溶解度以及生理和药理活性，需要以区域选择性和立体选择性的方式将羟基引入类固醇骨架中。例如，氢化可的松，一种典型的皮质类固醇，具有黄体酮 (PG) 骨架，并在 C11β、C17α和 C21 处进行三个羟基化修饰。

氢化可的松的传统生物合成途径包括三个步骤：（1）CYP17A1 催化 PG 在 C17 处羟基化，形成 17α-羟基-PG（a）；(2)a被 CYP21A2 羟基化并转化为 17α,21-二羟基-PG（皮质醇，c）；（3）CYP11B1 将c的 C11 羟基化成 11α/β氢化可的松。由于涉及多酶级联过程（三个步骤和六种酶），面临的挑战包括P450 酶活性低、细胞色素 P450 与细胞色素 P450 还原酶的复杂相互作用（CYP-CPR）、多酶级联反应缺乏协调以及不良副产物的积累。前人研究表明，传统的 PG 生物合成路线氢化可的松产量最高为 6.1 mg/L。

近日，周景文团队在ACS Catalysis发表了题为“Simplification of Corticosteroids Biosynthetic Pathway by Engineering P450BM3”的研究论文，该研究设计了一种自给自足的 P450BM3（来自巨大芽孢杆菌的CYP102A1），可以在大肠杆菌中以克级表达，将由 PG 合成氢化可的松的传统复杂过程简化为涉及至少两种酶的两步工艺，而不需要复杂的多次 CPR 匹配。

具体来说，该研究利用计算模拟策略指导，工程化改造底物进入通道和血红素中心袋，设计了一系列 P450BM3 变体，这些变体能够催化 PG 的 C16β、C17α、C21 和 C17α/21 氧化以及皮质醇的 C11α氧化。随后，对 P450BM3 变体模型进行分子动力学模拟表明，将对底物具有排斥性的残基突变成甘氨酸，使底物的催化基团更接近酶的活性位点。最后，开发的 P450 变体被用于构建高效的大肠杆菌催化系统，进一步实现了从 1 g/L PG一锅生产 11α/β-氢化可的松（f/e），摩尔转化率为 81% 和 84%（分别为 912 和 955 毫克/升）。

类固醇中存在丰富的惰性 C−H 键，在不产生过量副产物的情况下，实现类固醇主链的精确单次或多次氧化是一项艰巨任务。

细胞色素 P450 酶 (CYP450) 是在各种生物体中发现的一大类血红素结合蛋白，它们能够催化多种氧化转化反应，帮助代谢一系列药物和内源性化合物。对 P450 进行设计，可以实现精确氧化，已通过这种方式成功生产雄烯二酮 (AD)、脱氢表雄酮和睾酮等药物。

在这项研究中，研究人员利用计算模拟策略来指导 P450 酶工程，对底物进入通道和血红素中心进行工程设计。

底物有效进入血红素口袋对于 P450BM3 催化过程至关重要，因此需要促进底物 PG 进入到血红素中心。值得注意的是，野生型 (WT)-P450BM3 不能羟基化 PG。

▲图丨VD-BM3、VDSP-BM3、VD1721-BM3 的 MD 模拟分析（来源：ACS Catalysis）

然而，底物通道通常由大量疏水性残基组成，可能会阻碍了 PG 的惰性 CH 键进入血红素中心，从而阻碍了后续的羟基化。对此，研究人员通过MD 模拟来分析每个残基的 Debye−Waller 因子（B 因子）值，由 B 因子可以对蛋白质内原子、残基侧链和环区域的移动性和灵活性深入了解，据此进行工程化设计。总体而言，B 因子分析可以快速识别阻碍底物进入蛋白质的残基袋。

在工程化底物进入通道后，还需要增强区域选择性，有效策略是合理改造底物附近的残基，使底物的催化基团更接近酶的活性位点。

分析表明，仅在 VD-BM3（变体）的 S72 处引入最佳大构象残基有利于增强区域选择性，但降低了 PG 羟基化的转化率。因此，S72Q-VD-BM3 和 S72H-VD-BM3 的 L437 分别进一步突变为小构象的疏水残基。

▲图丨P450BM3 变体对 PG 羟基化的机制分析（来源：ACS Catalysis）

研究人员同时对 S72/L437/A330/A74 的四个残基进行饱和诱变，产生了204个变体。通过评估其中的 1920 个变体，鉴定了 5 个产生皮质醇的 VD-BM3 变体，转化率超过 40%。

尽管 VDSP-BM3 对血红素中心进行了修饰，可以对氧化单个位置碳表现出高选择性，但转化率相对较低。通过 100 ns 的 MD 模拟来探究转换率低的原因，经分析，将上述残基均单独突变为甘氨酸是增强 P450 催化口袋灵活性的有效策略。

最后，D433G-K435G-VDSP-BM3 变体 (VD1721-BM3) 的转化率显著提高，从 40% 提高到 89%，并且皮质醇生产的区域选择性从 62% 提高到 85%。

必须注意的是，一旦底物进入血红素中心，它会遇到来自口袋附近残基的不同力。例如，广泛的相互作用能网络可以稳定底物在口袋内的位置，而某些排斥力有可能反转底物的空间方向。

这些问题可以通过自由能计算有效解决，自由能计算可以细化口袋残基的相互作用能量，并获得具有最小尺寸突变库（17 个 P450 变体）的有效突变体。

最后，开发的 P450 变体被用于构建高效的大肠杆菌催化系统。

构建的新型全细胞催化系统包括 VD1721-BM3 和 FA11a-BM3（系统 1）或 VD1721-BM3 和 CYP5311B2-CPR（系统 2），并开发了 pETDuet-VD1721BM3-FA11aBM3 和 pETDuet-VD1721BM3-CYP5311B2-CPR 结构。

在大肠杆菌中诱导表达后，均匀收集细菌并重悬于 250 mL 锥形瓶中至 OD600 为 20，然后添加 1 g/L PG 和 1 mM NADP+。

▲图丨系统 1 (S1) 和系统 2 (S2) 中 PG 分别向 f 和 e 的转化率和选择性率（来源：ACS Catalysis）

在系统 1 中，VD1721-BM3 和 FA11a-BM3 均催化 PG 羟基化，生成 11α-氢化可的松，摩尔转化率为 81%。在系统 2 中，VD1721-BM3 和 CYP5311B2-CPR 均催化 PG 羟基化，生成 11β-氢化可的松，摩尔转化率为 84%。12 小时后，系统 1 和系统 2 基本完成反应，分别产生 912±2 mg/L 11α-氢化可的松和 955±1 mg/L 11β-氢化可的松。这是目前报道的从 PG 生物合成皮质类固醇的最高产率。本研究的产率比传统合成途径高 156 倍。

因此，在利用大肠杆菌催化系统，用自给自足的 P450 替代复杂的 CYP 和 CPR 匹配系统是提高目标产物合成效率的有效策略。使用 PG 作为底物合成氢化可的松也是一种更加环保且更具成本效益的生物合成方法。

总之，研究设计了能够催化 PG 的 C16β、C17α、C21 和 C17α/21 氧化以及 c 的 C11α氧化的 P450BM3 变体，并证明了这种转化在皮质类固醇合成中的实用性。研究强调了工程化自给自足的 P450 变体的巨大潜力，它为类固醇生物合成提供了可持续、高效和多功能的途径。先进计算模拟和合成生物学的结合为复杂甾体药物的合成提供了新的机遇。

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