《食品科学》：韶关学院柯野副教授等：棘孢木霉天冬氨酸蛋白酶基因的克隆表达及其对大豆分离蛋白的水解

大豆中蛋白氨基酸组成合理，且无饱和脂肪酸和胆固醇，具有良好的功能特性，是食品和饲料加工领域应用广泛的优质植物蛋白资源。但大豆中存在多种致敏原， 大豆球蛋白（11S）和β-伴大豆球蛋白（7S）是大豆中致敏性最强的两种蛋白。目前，常采用热处理法、酸碱化学法和生物酶解法降低或消除大豆蛋白的致敏性。发掘出更多、更高效的水解大豆蛋白并降低其致敏性的酸性蛋白酶有助于推动大豆蛋白更广泛的应用和发展。 棘孢木霉（ Trichoderma asperellum ）是 4 种生防效果优良的木霉菌之一，能分泌几丁质酶、纤维素酶、木聚糖酶和蛋白酶等多种胞外蛋白酶，这些酶协同作用发挥其生物防治功能，为开发木霉属真菌蛋白酶资源及挖掘蛋白酶的应用价值 。

韶关学院英东生物与农业学院的周迪，邱小娴，柯野*等人从棘孢木霉中克隆天冬氨酸蛋白酶基因asp，并在毕赤酵母（Pichia pastoris）中表达。对表达的重组蛋白酶rAsp成熟肽序列和同源建模分析，然后采用rAsp浓缩液水解大豆分离蛋白，研究rAsp对大豆分离蛋白的水解及降低大豆蛋白致敏性的效果，旨在为酸性蛋白酶应用于大豆蛋白加工或开发酸性蛋白酶饲料添加剂提供理论依据。

1asp基因的克隆和序列分析

将提取的棘孢木霉总RNA反转录成cDNA，以cDNA为模板，采用引物F和R进行PCR扩增，获得的产物片段与预期大小一致（图1）。PCR产物经纯化后连接至pEASY-Blunt载体上，转化至大肠杆菌DH5α菌株中，挑取阳性克隆子进行测序。测序结果表明，克隆的asp基因具有完整的开放阅读框，长度为1359bp，编码453个氨基酸。其DNA序列与数据库公布的序列存在27个碱基突变，相似性为98.01%；推测编码的氨基酸序列存在3个氨基酸残基突变，分别为D251G、S289A和N397D。将rAsp序列与GenBank数据库中的序列进行比对分析，显示其属于霉菌天冬氨酸蛋白酶家族（cd06097：Aspergillopepsin_like）。rAsp成熟肽序列与已报道的该家族其他成员序列的相似性均很低，与来自Aspergillus oryzae的天冬氨酸蛋白酶（PDB code：1izd）相似性最高（47.74%），与来自Trichoderma reesei的天冬氨酸蛋白酶（PDB code：3c9x）相似性为43.81%，与来自Penicillium janthinellum的青霉蛋白酶（PDB code：3app）相似性为44.66%，与来自Cryphonectria parasitica的天冬氨酸蛋白酶Endothiapepsin（PDB code：5hct）相似性为42.04%，与来自Rhizopus chinensis的天冬氨酸蛋白酶（PDB code：2apr）相似性为36.86%，与来自Aspergillus phoenicis的Aspergillopepsin I（PDB code：1ibq相似性为47.44%。这些序列的比对结果如图2所示。可见，rAsp是一种新型天冬氨酸蛋白酶，有必要进行深入研究。

根据GenBank数据库中的Conserved Domain Search Service分析，rAsp为含有一个Asp域的单体酶。根据同源建模的评分，以Trichoderma reesei天冬氨酸蛋白酶（PDB code：3c9x）为模板构建出rAsp的3D结构（图3）。rAsp与其他霉菌天冬氨酸蛋白酶的三维结构和催化机制相似，即由2个相似N端β-桶域和C端β-桶域构成，在桶域之间形成一个催化裂缝（cleft），便于底物多个残基与之结合，达到定向固定底物作用；每个桶域中DT (S) G Motif结构中的活性催化D残基亲核攻击底物肽键，达到水解底物作用。rAsp与其他6种酶相比（以序列比对中rAsp第1个氨基酸残基Q序号定义为1，以此类推），增加126～131、145～150、161～164、183～185和262～264位点的残基片段，促使其具有更长Loop结构；rAsp的126～127位点不是保守的cis肽键，M259-W295不能形成保守的二硫键结构。对于底物特异性非常重要的C结构域第二flap环（302～307位点）而言，该环中含有高度保守的G306，该残基对底物构象定向和定位具有重要作用；在rAsp中，高度保守G突变为具有更大侧链基团P残基，以及非极性I305突变为极性N，这可能更利于侧链基团小和极性强的底物结合。rAsp结构中氨基酸残基、二级结构等方面的差异对rAsp分子结构和性质的改造具有一定的指导作用。

2重组表达载体的构建和毕赤酵母工程菌株的筛选

将线性化的重组表达载体pICH/asp电转至毕赤酵母GS115后，电转菌悬液涂布在MD平板上，28 ℃培养72 h后，从中挑取单菌落至含1%脱脂奶粉的MM培养基上，以单菌落周围产生透明水解圈为筛选标志（图4），挑取具有最大水解圈直径的转化子进行酵母基因组PCR鉴定。由图5可知，以引物F和R扩增获得了asp基因的产物；以引物AOX扩增获得了2种产物，分别为含有asp基因的重组表达载体pICH/asp序列和毕赤酵母AOX1基因序列。以上结果表明，重组毕赤酵母工程菌株成功构建并得到表达。

3重组毕赤酵母工程菌株的诱导表达和rAsp的纯化

重组毕赤酵母工程菌株在三角瓶中诱导表达，当发酵至144 h，发酵液酶活力达到最大，约为25.8 U/mL，明显高于从棘孢木霉中克隆的天冬氨酸蛋白酶rAsp55（最高酶活力9.52 U/mL）和rTaAsp（最高酶活力18.5 U/mL），表明rAsp获得了高效表达，为该蛋白酶的应用研究提供了保障。发酵上清液经切向流膜过滤系统浓缩、离心超滤管浓缩和Sephadex G-75凝胶过滤层析，纯化获得了单一蛋白条带（图6）。根据相对迁移率和分子质量的关系，计算出该蛋白条带的大小为49.1 kDa，与克隆的asp基因序列推导编码的氨基酸序列分子质量大小一致，表明此单一蛋白条带为rAsp。

4pH值和温度对rAsp活力及稳定性的影响结果

由图7A可知，rAsp的最适反应pH值为2.5，低于来自同种的rTaAsp（pH 4.0）及同属哈茨木霉的SA76（pH 3.5）；rAsp在pH 2.0～6.0较广范围内稳定性好，在4 ℃孵育24 h后仍保留了90%以上的残余活力。当pH值高于6.0以后稳定性急剧下降，pH值到达7.0以后活性完全丧失。这表明rAsp在酸性条件下具有良好的酶促反应活性和稳定性，能很好地适应动物胃肠道环境，具有作为饲料添加剂的应用潜能。由图7B、C可知，rAsp的最适反应温度为45 ℃，在45 ℃以下稳定性良好，45 ℃孵育120 min仍保留77%以上的活力，当温度高于50 ℃时活力下降明显，55 ℃孵育10 min活性完全丧失。

5金属离子和化学试剂对rAsp活力的影响

如表1所示，Fe 3＋ 和SDS能显著抑制rAsp的活力，其他金属离子和化学试剂促进或不显著影响rAsp的活性。其中，Cu 2＋ 和Mn 2＋ 对rAsp的活性具有促进作用，分别使其相对酶活力提高19.90%和24.23%。可能是由于Cu 2＋ 和Mn 2＋ 稳定了蛋白酶的三级结构所致；胃蛋白酶抑制剂几乎完全抑制rAsp的活性，而苯甲磺酰氟、亮肽素和抑肽酶对其活力影响不明显，表明rAsp是一种天冬氨酸蛋白酶。不同浓度的乙二胺四乙酸（ EDTA）对rAsp活力影响不大，表明rAsp活力不显著依赖于金属离子。rAsp对大部分金属离子和化学试剂的稳定性显示了其在食品和饲料工业上广泛应用的潜力。

6rAsp和胃蛋白酶对大豆分离蛋白的水解

为探索rAsp在水解大豆分离蛋白上的应用，将rAsp和胃蛋白酶分别在相同条件下水解大豆分离蛋白。由图8可知，随着水解的不断进行，在rAsp和胃蛋白酶不同时间的水解产物中，两种主要致敏原如β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白各亚基条带逐步被降解甚至消失。5 min时，β-伴大豆球蛋白的α’（71 kDa）、α（67 kDa）和β亚基（49 kDa）被rAsp和胃蛋白酶完全降解，大豆球蛋白的酸性亚基A（38 kDa）被部分降解，碱性亚基B（21 kDa）被rAsp降解，仅剩分子质量小于25 kDa的弥散带；而此时胃蛋白酶的水解液中产生了34、31 kDa及≤5 kDa的蛋白带。60 min后，rAsp和胃蛋白酶继续水解大豆分离蛋白，直至逐步将大分子片段降解为小分子肽。水解终点时，rAsp水解液中仅见＜14.4 kDa的小分子肽，而胃蛋白酶水解液中在14.4～25 kDa之间仍存在一些未被降解的弥散带，且＜14.4 kDa的小分子带颜色明显比rAsp水解液深。相对蛋白含量的变化（图9）显示，随着水解的进行，rAsp和胃蛋白酶水解产物中相对蛋白含量在水解前60 min下降剧烈，在水解终点时趋于稳定，剩余相对蛋白含量分别为21.1%和28.8%，rAsp对大豆分离蛋白的水解效率比胃蛋白酶高7.7%。

水解终点时，ELASA检测结果显示，rAsp使β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白的致敏性分别降低了35.9%和27.9%；而胃蛋白酶相应使其降低了26.1%和15.6%。可见，rAsp降低β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白致敏性的能力分别约为胃蛋白酶的1.4倍和1.8倍。因此，SDSPAGE图谱、相对蛋白含量和致敏性变化结果表明，rAsp对大豆分离蛋白的水解能力明显强于胃蛋白酶；且水解降低大豆分离蛋白致敏性的效果强于相同条件下的胃蛋白酶，具有应用于大豆蛋白深加工或作为饲料添加剂的潜力。

结 论

本研究从T. asperellum克隆天冬氨酸蛋白酶asp基因，并使其在毕赤酵母中成功表达。在三角瓶中诱导表达时，rAsp发酵液的酶活力最高可达25.8 U/mL。rAsp的最适反应pH值为2.5，最适反应温度为45 ℃；在pH 2.0～6.0范围内和低于45 ℃条件下稳定性好。rAsp和胃蛋白酶均能很好地降解大豆分离蛋白，使β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白各亚基完全水解；然而，rAsp对大豆分离蛋白的水解效率比胃蛋白酶高7.7%，而且对β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白致敏性降低率分别比胃蛋白酶高9.8%和12.3%。

综上所述，rAsp适应pH值范围广，特别是与动物消化系统酸碱环境相吻合，而且在降低和消除大豆蛋白致敏性方面具有显著优势，是一种新型高效的酸性蛋白酶。本研究不仅丰富了蛋白酶库内容以及为大豆食品加工产业和相应动物饲料产业提供了有力支撑，也为大豆蛋白酶水解的深入研究奠定了基础。

本文《棘孢木霉天冬氨酸蛋白酶基因的克隆表达及其对大豆分离蛋白的水解》来源于《食品科学》2023年44卷第20期175-182页，作者：周迪，邱小娴，柯野，胡秋怡。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20230212-105。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑；云南农业大学食品科技学院 李曦明；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。

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