中科院1区-南中医: 仙连解毒方通过调节代谢谱、肠道菌群和代谢物缓解结直肠癌

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导读

仙连解毒方(XLJDD)因其显著的疗效被用于治疗结直肠癌(CRC)。尽管XLJDD具有明显的临床疗效，但其抗CRC的作用机制仍不清楚。本研究揭示XLJDD对偶氮甲烷/右旋糖酐硫酸钠（AOM/DSS）诱导的小鼠CRC的抑制作用及其机制；采用AOM/DSS诱导的小鼠模型，评价不同剂量XLJDD给药后的疗效；通过组织病理学、免疫荧光和ELISA分析方法，研究XLJDD对AOM/DSS诱导的CRC的治疗作用；此外，还使用代谢组学图谱和16S rRNA分析来探索XLJDD治疗CRC的有效机制。结果显示，XLJDD降低了结肠内壁肿瘤生长数量和结肠重/长比，抑制了疾病活动指数（DAI）评分，同时增加了体重、结肠长度和总生存率。XLJDD降低血清中炎性细胞因子水平和降低结直肠组织中β-连环蛋白、COX-2和iNOS蛋白表达水平的能力，表明XLJDD具有抗炎特性，可以缓解炎症相关疾病。从机制上讲，XLJDD改善了肠道微生物群失调和相关的短链脂肪酸（SCFAs）、鞘脂和甘油磷脂代谢水平。这是通过降低Turicibacter、Clostridium_sensus_stricto_1的丰度以及鞘氨醇、LPCs和PC的水平来实现的。此外，XLJDD增加了Enterorhabdus和Alistipes益生菌的丰度，以及丁酸和异戊酸的含量。本文提供的数据表明，XLJDD可以通过降低炎症水平、缓解肠道微生物菌群失衡和代谢紊乱，有效抑制结肠内壁肿瘤的发生。为CRC的临床防治提供了科学依据。

论文ID

原名：Xianlian Jiedu Decoction alleviates colorectal cancer by regulating metabolic profiles, intestinal microbiota and metabolites

译名：仙连解毒方通过调节代谢谱、肠道菌群和代谢物缓解结直肠癌

期刊：Phytomedicine

IF：7.9

发表时间：2024.01

通讯作者：宿树兰，段金廒

通讯作者单位：南京中医药大学

实验设计

实验结果

1. XLJDD的化学成分及定量分析

我们通过UPLC-QTOF/MS分析鉴定了XLJDD的17个成分，主要含有生物碱、有机酸和黄酮类化合物（补充表S1；图1A、B）。我们定量分析了四种成分，包括苦参碱（3.02 mg·g−1）、氧化苦参碱（1.90 mg·g–1）、黄连碱（0.53 mg·g-1）和黄连素（1.09 mg·g-1）（表3；图1C、D）。

表1 4种分析物多反应监测(MRM)信息

图1 UPLC-Q/TOF-MS分析的总离子流图（A-正离子模式，B-负离子模式）和UPLC-TQ/MS分析的总电离流色谱图（C-混合对照溶液，D-XLJDD样品溶液）。

表2 疾病活动指数（DAI）评分标准

表3 4个成分的回归方程、相关系数及线性范围

2. XLJDD抑制AOM/DSS诱导小鼠的肿瘤发生

如实验方案所示（图2A），我们在AOM/DSS模型中检查了两种不同剂量的XLJDD（11和44 g/kg/d）和奥沙利铂对结直肠组织学和肿瘤相关表型的影响。结果显示，阳性药物奥沙利铂对体重增加有负面影响，而XLJDD可以有效缓解模型中的腹泻、直肠脱垂和体重减轻（图2B-C）。存活曲线还显示，XLJDD处理提高了实验期间AOM/DSS处理的小鼠的存活率。奥沙利铂组的存活率在第一阶段显著降低（图2G）。结肠内壁上肿瘤生长的数量、结肠的长度以及结肠的质量与长度的比率是评估CRC严重程度的直观指标。在对动物实施安乐死之后，我们发现与模型组相比，XLJDD组和奥沙利铂组的结肠直肠肿瘤负荷和数量显著减少，结肠长度和结肠重/长比增加（图2D-F）。总之，这些结果表明，XLJDD在AOM/DSS诱导的CRC模型中的显著抗肿瘤作用是以剂量依赖的方式产生的。

图2 XLJDD在AOM/DSS模型中显著抑制肿瘤的发生和发展。（A）动物实验设计。（B）每3天记录一次小鼠疾病活动指数（DAI）评分的变化。（C）每周记录小鼠体重的变化。（D）133天后测量息肉数量、（E）结肠长度和（F）结肠重量/长度。（G）五个不同组小鼠的Kaplan-Meier生存曲线。（A-G）n = 每组8-15只小鼠，平均值±SD，p值通过单因素方差分析进行分析。n = 8-15，与对照组相比，###p＜0.001；与模型组相比，*p＜0.05，**p<0.01，***p＜0.001。

3. XLJDD减轻了组织损伤和肠道炎症

结肠直肠物理图像如图3A所示。H&E染色显示AOM/DSS可引起严重的肠道炎症。在结直肠切片中，我们观察到上皮发育不良和细胞核分裂，XLJDD和奥沙利铂可显著减少细胞核分裂和炎症细胞浸润（图3A-C）。先前的研究表明，β-连环蛋白是检测结直肠癌前病变的指标。XLJDD可以降低结直肠组织中β-连环蛋白阳性细胞的比例（图3B，C）。此外，炎症的存在与iNOS和COX-2的上调有关，从而增加癌症的风险。在本研究中，模型组iNOS和COX-2的表达水平增加，而XLJDD和奥沙利铂处理后显著减少了这种增加（图3B、C）。促炎细胞因子分析还显示，处理后小鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α和IFN-γ的水平在一定程度上降低（图3D）。总之，XLJDD可以有效抑制肿瘤相关炎症和CRC的发展。

图3 XLJDD可减少组织损伤、肠道炎症和肿瘤发展。（A）小鼠结肠的大体病理学和组织学图像。核分裂（红色箭头）、隐窝脓肿（黄色箭头）、腺腔扩张（灰色箭头）、炎症细胞浸润到黏膜下层（蓝色箭头）和肠道增生（绿色箭头）。（B）结肠组织的免疫荧光（比例尺：50μm，n=3）。（C）组织病理学评分和结肠组织中β-连环蛋白、COX-2、iNOS阳性细胞的百分比，n=3。（D）小鼠血清中炎症因子的含量，n=8。（A-D）数据表示为平均值±SD，与对照组相比，##p＜0.001，###p＜0.001；与模型组相比ns p＞0.05，*p＜0.05；**p＜0.01，***p＜0.001。

4. XLJDD促进AOM/DSS诱导小鼠结直肠SCFAs的释放

我们通过GC-FID测定AOM/DSS诱导的小鼠结肠内容物中六种SCFA的含量（补充表S2；补充图S1）。与对照组相比，AOM/DSS显著降低了结肠内容物中丙酸、异丁酸、异戊酸和戊酸的浓度（p<0.01）。XLJDD处理后，CRC小鼠结肠中丙酸、异丁酸、异戊酸和戊酸的含量显著增加（p<0.05）。XLJDD具有增加乙酸和丁酸含量的趋势（p>0.05）。奥沙利铂处理后，小鼠短链脂肪酸含量没有显著增加（p>0.05）。特别是低剂量XLJDD有利于丙酸和异丁酸的释放，而高剂量XLJDD更有利于异戊酸和戊酸的释放（图4）。

图4 短链脂肪酸（SCFAs）对小鼠结肠内容物产生的影响。（A）乙酸。（B）丙酸。（C）异丁酸。（D）丁酸。（E） 异戊酸。（F）缬草酸。（A-F）数据表示为平均值±标准差，n=8。与对照组相比，ns p＞0.05，##p＜0.001；### p＜0.001。与模型组相比，ns p＞0.05；*p＜0.05；***p＜0.001。

5. XLJDD调节AOM/DSS诱导的小鼠肠道菌群失调

为了确定XLJDD对肠道菌群的调节作用，我们首先进行了alpha多样性分析。物种丰富度指数显示，模型组的Sobs、Ace和Chao指数显著低于对照组（p<0.05）（图5A-D）。接下来，我们进行了beta多样性分析，以探索不同组之间群落组成的相似性和差异性。PCA和PCoA分析结果显示，空白组与模型组距离较远，物种组成差异较大，表明AOM/DSS诱导的CRC疾病状态下小鼠的粪便菌群发生了显著变化。给药后在一定程度上偏离模型组，接近正常组，表明XLJDD和奥沙利铂在一定程度上改善了CRC小鼠的粪便菌群多样性（图5E，F）。

图5 XLJDD调节AOM/DSS小鼠肠道微生物丰富度和多样性。（A）Ace指数。（B）Chao指数。（C）Sobs指数。（D）Shannon指数。（E）主成分分析（PCA）分析。（F）主坐标分析（PcoA）分析。（A-F）数据表示为平均值±标准差，n=8。与对照组相比，#p＜0.05，## p＜0.01。

我们分析了各类群在门和属水平上的分类组成。直方图显示，所有样品均含有厚壁菌、拟杆菌、放线菌、脱硫菌、变形菌（图6A）；厚壁菌和拟杆菌是最丰富的属。另一方面，属水平主要包括Ileibacterium、Dubosiella、norank_f__Muribaculaceae、乳杆菌、Turicibacter（图6B）。在门的水平上，我们发现厚壁菌门和拟杆菌门在模型组中最为丰富。在属水平上，与模型组相比，XLJDD组和奥沙利铂组中Ileibacterium、norank_f__Muribaculaceae和乳杆菌的丰度增加。然而，Turicibacter的丰度降低了。因此，XLJDD和奥沙利铂可以增加肠道有益菌（Ileibacterium、乳杆菌）的丰度，降低有害菌Turicibacter的丰度，改变肠道细菌的组成，防止肿瘤的发生。

图6 XLJDD处理后AOM/DSS小鼠的肠道微生物群落结构。（A）根据门划分的微生物群落条形图。（B）按属划分的微生物群落条形图。

为了找到不同群体中肠道微生物群的关键系统类型和生物标志物，我们通过LEfSe对高维类别进行比较和分析，发现各组之间的细菌群落优势存在显著差异（补充图S2A）。结果显示，Turicibacter和Duboseella是导致模型组肠道菌群失衡的关键细菌类型（补充图S2B）。在XLJDD和奥沙利铂的作用下，与对照组相比，模型组Lachnospiraceae_NK4A136_group、Enterorhabdus和Alistipes的丰度显著增加（p<0.05）（图7A-C）。然而，Turicibacter、Romboutsia和Clostridium_sensus_stricto_1显著减少（p<0.05）（图7D-F）。

图7 XLJDD对关键细菌的调节。（A-F）给药后关键细菌的响应。数据表示为平均值±标准差，n=8。与对照组相比，#p＜0.05，###p＜0.001；与模型组相比，*p＜0.05，**p<0.01，***p＜0.001。

6. XLJDD改变了AOM/DSS诱导小鼠的代谢谱

我们通过UPLC-Q-TOF/MS对血浆和粪便样品进行代谢组学分析，综合鉴定血浆内源性代谢产物57种，粪便内源性代谢产物97种（补充表S3）。从PCA和OPLS-DA的得分（图8A-B）可以看出，对照组和模型组之间存在显著差异，表明模型稳定准确。随后，为了研究药物对差异代谢产物的调节，我们发现在CRC发生显著变化后，XLJDD和奥沙利铂治逆转了29种差异代谢产物（图9）。因此，这些代谢产物被认为是XLJDD和奥沙利铂调节CRC的关键代谢产物。

图8 基于血浆和粪便代谢产物谱以及XLJDD调节的关键代谢途径。在正离子（1，3）和负离子（2，4）模式下，对照和模型的血浆（1，2）和粪便（3，4）的主成分分析（PCA）（A1-A4）、正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）（B1-B4）和OPLS-DA的S图（C1-C2）。（D）XLJDD调节的关键代谢途径。

图9 XLJDD调节的关键差异代谢产物。（A）血浆中的关键差异代谢产物。（B）粪便中的关键差异代谢产物。数据表示为平均值±标准差，n=8。与对照组相比，#p＜0.05，##p＜0.01，###p＜0.001；与模型组相比，*p＜0.05，**p<0.01，***p＜0.001。

MetaboAnalyst 5.0用于分析XLJDD变化的最显著代谢途径。研究发现，这些差异代谢产物大多与脂质代谢、氨基酸代谢和有机酸代谢有关，这与PICRUSt分析的结果一致（图8D）。其中，鞘脂代谢、甘油磷脂代谢相关性最强（p<0.05，影响>0.1），提示这两种代谢途径是XLJDD治疗CRC的关键途径。

7. 肠道菌群与临床因素的相关性分析

CRC与炎症密切相关，肠道微生物群结构的变化也会影响宿主的代谢表型。因此，我们采用Spearman相关分析法探讨服用XLJDD后三者之间的相关性。炎症因子与肠道菌群的相关性研究表明：Turibacter和clostridium_sensu_stricto_1与炎症因子呈正相关，Alistipes、Alloprevotella和Rikenella呈负相关（补充图S3A）。

基于肠道菌群和SCFAs的数据，Spearman分析后的数据显示，丁酸、丙酸和异戊酸与肠道细菌的相关性最大（补充图S3B）。此外，Alistipes、Alloprevotella、阿克曼菌和Parabacteroides呈强正相关，乳球菌、Romboutsia、clostridium_sensus_stricto_1呈强负相关。

我们对29种可被XLJDD逆转的关键代谢产物和50种肠道微生物进行Spearman相关性分析（补充图S3C）。结果表明，关键代谢产物如鞘氨醇，LysoPC（20:4（8Z，11Z，14Z，17Z）），LysoPC（20:4（5Z，8Z，11Z，14Z）），LysoPC（22:5（7Z，10Z，13Z，16Z，19Z）），PC（22:5（7Z、10Z、13Z、16Z、19Z）/18:1（9Z））和PC（22:6（4Z、7Z、10 Z、13Z、16Z和19Z）/20:1（11Z）），前列腺素E2与Alloprevotella、Muribaculum、Alistipes、阿克曼菌、Colidextribacter和Jeotgalicoccus呈负相关。然而，它们与Dubosiella、乳杆菌、Turicibacter、Rikenellaceae_RC9_gut_group、Clostridium_sensus_stricto_1和Romboutsia具有很强的正相关性。

基于上述结果，我们通过cytoscape 3.9.0软件构建了在施用XLJDD后表现出差异表达的关键细菌属和关键代谢产物的共表达网络（图10）。涉及6个关键肠道微生物群属和29个关键代谢产物的关键代谢途径包括鞘脂代谢、甘油磷脂代谢、花生四烯酸代谢、嘌呤代谢、组氨酸代谢和不饱和脂肪酸生物合成。共表达网络显示鞘脂代谢与Turicibacter、Clostridium_sensu_stricto_1和Romboutsia有较强的正相关，表明它们可能促进鞘氨醇的硫化。结果表明，甘油磷脂代谢与三个属具有较强的正相关关系，表明上述细菌可富集参与甘油磷脂途径的溶血磷脂和磷脂酰胆碱代谢产物。共表达网络显示花生四烯酸代谢与三个属具有很强的正相关关系，揭示了上述细菌可以富集参与花生四烯酸途径的前列腺素E2代谢产物。

图10 XLJDD作用后显示差异表达的关键属和关键代谢产物之间的共表达网络。菱形代表不同的属，圆圈代表不同的代谢产物。

根据特异性细菌的共表达和相互作用网络，我们推测Turicibacter、Clostridium_sensus_stricto_1、Romboutsia、Alistipes、Enterorhabdus和Lachnospiraceae_NK4A136_group为功能特异性细菌，这可能在XLJDD作为CRC治疗策略的发展中发挥作用。上述结果表明，这六种细菌可以作为特定细菌，在有限的样本中区分健康小鼠和CRC小鼠。XLJDD可能通过降低Turicibacter、Clostridium_sensustricto_1和Romboutsia菌属的丰度以及增加Alistipes的丰度，在CRC治疗中发挥重要作用。Enterorhabdus和Lachnospiraceae_NK4A136_group细菌属在CRC的治疗中发挥着重要作用，但这一结论需要在更大的样本量中进一步验证。

许多研究表明，慢性炎症与CRC的发生过程密不可分。炎症相关蛋白如COX-2和iNOS参与了这一过程。本研究结果表明，XLJDD可显著降低CRC小鼠的DAI评分，减少肿瘤的数量和大小，抑制肿瘤细胞的生长。此外，XLJDD通过调节COX-2蛋白和iNOS蛋白显著降低癌症风险，并通过减少促炎因子（TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ）减轻慢性炎症。这些结果表明，XLJDD预防和治疗CRC可能与减少宿主炎症反应有关。

众所周知，CRC也会发生肠道菌群的变化。我们的研究发现，在门水平上，厚壁菌门的相对丰度显著增加，拟杆菌门和变形菌门的水平显著下降。然而，XLJDD阻碍了这些变化。在属水平上，XLJDD处理后，Lachnospiracea_NK4A136_group、Enterorhabdus和Alistipes的丰度显著增加。据报道，与慢性肠道炎症相关的CRC小鼠模型是Lachnospiracea_NK4A136_Group减少。此外，Alistipes已被证明通过调节肿瘤微环境在癌症免疫疗法中发挥有益效果。在XLJDD存在的情况下，Turicibacter、Romboutsia和Clostridium_sensus_stricto_1的丰度显著降低。据报道，Turicibacter通常与宿主炎症有关，在AOM/DSS处理后的荷瘤小鼠中检测到大量的Turicibacter 。总之，XLJDD可能通过以一种新的作用方式调节肠道微生物群，发挥益生元和抗CRC的作用。

据报道，肠道细菌通过在循环系统中产生小分子来调节宿主代谢。通过对CRC小鼠的血浆和粪便进行非靶向代谢组学分析，我们进一步探讨了XLJDD对肠道微生物的影响。服用XLJDD后，血浆中的16种代谢产物和粪便中的13种代谢产物被调节到正常对照水平。XLJDD干预后鞘氨醇水平显著下调，1-磷酸鞘氨醇是通过鞘氨醇激酶磷酸化鞘氨醇产生的，鞘氨醇可作为鞘脂代谢的调节分子。据报道，它可以促进癌症细胞的增殖和存活。溶血磷脂酰胆碱（LPC）的浓度在炎症条件下显著增加，通常被认为是一种有效的促炎和有害物质。然而，越来越多的研究表明，它也具有抗炎活性。在本研究中，给药后LysoPC（16:1（9Z））、LysoPC（20:0）和LysoPC（P-18:0）的水平显著上调。LysoPC（20:4（8Z、11Z、14Z、17Z））和LysoPC（20:4（5Z，8Z，11Z，14Z））的水平显著下调。提示XLJDD可调节肠道菌群的鞘脂代谢和甘油磷脂代谢，减少炎症反应，从而抑制CRC的发生和发展。

短链脂肪酸是微生物通过发酵产生的代谢产物。据报道，不可消化的碳水化合物通过特定的肠道微生物转化为短链脂肪酸。SCFAs不仅可以作为能量来源，还可以作为代谢和信号转导分子。越来越多的证据表明，短链脂肪酸对身体有调节作用，例如，长链脂肪酸可以通过抑制炎症因子的释放来改善炎症性肠病。本研究评估了服用XLJDD后的SCFA水平（乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸和异戊酸），并表明CRC的抑制和炎症水平的降低可能与SCFAs的产生有关。与先前粪便微生物分析的结果一致，SCFAs的产生分别与Alistipes、Alloprevotella、阿克曼菌和Parabacteroides等有益细菌呈正相关。

结论

总之，XLJDD对AOM/DSS诱导的小鼠CRC具有显著的保护作用，为CRC的预防和治疗提供了新的选择。上述结果表明，XLJDD不仅可以抑制肠道的过度炎症反应，还可以通过肠道中的各种代谢途径恢复肠道菌群的稳态，改变肠道中的微生物代谢产物。这些功能可能与肠杆菌和Alistipes关键属的富集以及XLJDD对脂质代谢水平的调节有关。这些可能是XLJDD治疗CRC的潜在靶点。本研究对XLJDD治疗CRC的潜在分子机制提供了全面深入的了解，有望成为一种新的治疗方法。

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0944711324000503

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