江南大学提出微生物合成高纯度乳糖-N-岩藻戊糖I新策略

母乳低聚糖（HMO）是母乳的第三固体成分，具有调节免疫、帮助大脑发育及调节肠道菌群等功能，有助于婴幼儿成长发育。在过去的十年里，有 8 种 HMOs 被美国食品药品监督管理局批准为普遍公认安全（GRAS）。HMO 在食品行业产生的商业价值也推动了其工业化量产的发展。目前，代谢工程微生物合成法是工业生产 HMO 的主要途径，在构建 HMO 生产菌株时，应考虑三个重要因素，包括促进供体供应，引入特定糖核苷酸依赖性糖基转移酶，以及加强相应糖核苷酸的合成。

在 8 种被认为是 GRAS 的 HMOs 中，乳糖-N-岩藻戊糖 I(LNFP I）是结构最复杂的一种，其在母乳中含量排到第五，因此它的工业化生产受到了广泛关注。通过乳糖基化生产 LNFP I 分为三步：乳糖→乳糖-N-三糖 II（GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc，LNTri II）→乳糖-N-四糖（LNT）→乳糖-N-岩藻戊糖 I (LNFP I)。这三个步骤是由三种糖基转移酶催化完成的，它们分别是 β-N-乙酰葡萄糖胺基转移酶（β-GlcNAcT）、β1,3-半乳糖基转移酶（β1,3-GalT）和 α1,2-fucosyltransferase（α1,2-FucT），并分别以 5′-二磷酸盐（UDP）-N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）、UDP-半乳糖和鸟苷 5′-二磷酸盐（GDP）-L-fucose 作为糖基化供体。为了构建 LNFP I 合成的完整途径，应引入这三种糖基转移酶并加强相应糖核苷酸（LNTri II，LNT 和 LNFP I）的合成通路。

LNTri II 和 LNT分别是 LNFP I 微生物合成的间接和直接前体，目前对于 LNTri II 和 LNT 的微生物合成已有成熟的研究，其中LgtA和WbgO是常用的工程菌，以提供相应的糖基转移酶 β-GlcNAcT 和 β1,3-GalT。然而，关于 LNFP I 的体内生物合成的研究并不多。

近日，来自江南大学食品科学及资源国家重点实验室的沐万孟团队开发了一种高效合成 LNFP I 的微生物代谢工程策略，并获得高产高纯的 LNFP I，最佳工程菌株在摇瓶和流加培养中分别生产 4.42 g/L 和 35.1 g/L LNFP I，从而进一步推广了这种 HMO 在实际生活中的大规模生产应用。这项成果已经以“Microbial Synthesis of Lacto‑N‑fucopentaose I with High Titer and Purity by Screening of Specific Glycosyltransferase and Elimination of Residual Lacto‑N‑triose II and Lacto‑N‑tetraose”为题发表在Journal of Agricultural and Food Chemistry上。

此次沐万孟团队在研究过程中，针对乳糖基化生产 LNFP I 所需要的三种糖基化转移酶，他们构建了一种新的工程菌。首先通过多拷贝基因组合，将 lgtA 引入大肠杆菌，产生 β-GlcNAcT 生成 LNTri II；然后通过 wbgO 的染色体整合，增强 LNT 的生成；最后引入了大肠杆菌 O128:B12 的 α1,2-FucT，名为 WbsJ，并伴随着 de novo GDP-L-fucose 途径模块，从而生成了 LNFP I。

在这个过程中，科学家为了寻找更适合 LNFP I 体内生物合成的 α1,2-FucT。从各种微生物中选择了 16 种与大肠杆菌 WbsJ 具有约 30% 氨基酸同一性的候选者。研究表明，ENP12-03 的LNFP I 产量最高并且副产物 2’-FL 含量小于 0.1 g/L，从而提高 LNFP I 的纯度。

▲图 | 通过筛选各种 α1,2-FucT 增强 LNFP I 的微生物合成 （来源：上述论文）

wbgO 的染色体整合可以加强LNTri II 到 LNT 的合成通路，作为 LNFP I 的直接前体。在选定的 ENP12-03 基础上，研究人员选择三个位点：pta、poxB 和 wecBC，用于 wbgO 与 tac 启动子的单拷贝、两拷贝和三拷贝整合，分别产生菌株 ENP12-03-01、ENP12-03-02 和 ENP12-03-03。与 ENP12-03 相比，所有 wbgO 集成工程菌株都产生了更高的 LNFP I，同时保留了较低的 LNTri II 和 LNT。具有双拷贝 wbgO 集成的菌株 ENP12-03-02产生了 LNFP I 的最高滴度（4.42 g/L），与控制菌株 ENP12-03 相比增加了 26%。只保留了 0.39 g/L LNTri II 和 0.12 g/L LNT。

▲图 | wbgO 的染色体整合，增强 LNFP I 生物合成。（A）选择用于在 tac 启动子下集成 wbgO 的染色体位点。（B）各种工程菌株的 HMO 合成比较。（来源：上述论文）

此外，为了消除反应过程残留的 LNTri II 和 LNT，科学家们使用共表达B. bifidumBbhI 和 LnbB 的重组菌株，可以在 3.5 小时内完全降解残留的 LNTri II 和 LNT，进一步提升了 LNFP I 的纯度。

综上所述，可以看出，此次江南大学的学者针对微生物合成 LNFP I 的新策略，在实现高产的 LNFP I 的同时，降低副产物的产生，消除了残基，最终获得了高产、高纯的 LNFP I，为其在实际应用中的大规模生产提供了支持。

本文通讯作者沐万孟是江南大学食品科学与技术国家重点实验室、食品学院教授、博士生导师。主要从事食品酶与食品酶工程、食品功能配料生物制造等应用基础和产业化研究。

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