在渔业养殖中，微生物对环境影响严重，如何治理水体中细菌群落？

文|面包夹知识

编辑|面包夹知识

?——【·前言·】——?

由于水产品在人类饮食中的比重不断提高，水产养殖业得到迅猛发展，对水生生态环境健康带来了潜在影响。

渔业养殖过程中施用了大量的肥料、饵料和化学药剂，使得水体和沉积物中碳、氮、磷和硫元素含量增加和积累，同时各类抗生素含量也显著提高，带来区域水体富营养化、抗生素污染等一系列环境问题.

细菌对外界环境变化极为敏感，在有效监测养殖水体和沉积物环境质量，评价水生生态系统功能健康和维持方面均具有重要的地位.

水产养殖条件下水体和沉积物中的细菌组成及优势种群存在着显著差异，其中沉积物环境比水体拥有更高的细菌丰度和多样性.

渔业养殖可以影响水体和沉积物细菌群落结构，降低沉积物细菌多样性，并对细菌群落产生较持久的影响.

渔业养殖促进了沉积物变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、绿弯菌门和螺旋体菌门大规模增加，更有利于厌氧细菌类群（如Anaerolineae纲）的生长。

也刺激与碳循环及硫循环（如δ-变形菌）相关细菌的出现与富集.渔业养殖还促使沉积物细菌密度和生物量成倍增长，其中革兰氏阴性细菌等耐药性微生物数量显著增加.

同时渔业养殖还导致水体环境潜在的致病菌（如弧菌）及一些病原微生物富集，导致与鱼类疾病相关的细菌类群数量不断增加，进而增加了由食源性病原体引起的人类感染风险.

分子生态网络分析法是分析和评估环境变化对微生物群落结构、功能和生态系统稳定性影响的有效工具.

现在来说，浙江以及福建和海南等一些企业，已经对有关渔业养殖对水体和沉积物微生物群落结构的研究已有一些成果，但针对渔业养殖如何影响细菌分子生态网络特性及其功能潜势相关研究甚少。

而长江水系发达，所以实验选取了中下游湖泊区的菜子湖区自然湖泊，及其临近的养殖塘为水样和沉积物采样区，通过对水体和沉积物细菌高通量测序数据进行处理与分析。

讨论渔业养殖对水体和沉积细菌群落结构、多样性、分子生态网络特征和功能潜势的影响，以期丰富水产养殖对微生物生态系统影响的认识.

?——【·材料与方法·】——?

菜子湖位于安徽省安庆市北部，南临长江.水面由菜子湖、嬉子湖和白兔湖3部分构成，合称菜子湖.湖区4－10月为丰水期，11月－翌年3月为枯水期，是长江中下游地区

典型的浅水通江湖泊.养殖塘是在自然湖泊沿岸，通过筑厚坝围隔方式形成封闭的渔业养殖塘（图1）.

2021年11月前期调研基础上，于2022年1月环绕菜子湖水域，分别选取4个养殖塘（F命名）及相邻或相近的自然湖泊样点（N命名）作为比照.F1和N1位于金神镇周家咀的幸福圩；F2和N2位于金神镇的王家同。

F3和N3位于嬉子湖镇的榆咀；F4和N4位于雨坛镇的王家咀.F1、F3进行渔业养殖约有40多年，当前仍在养殖。

F2渔业养殖约有50多年，已休养1年；F4进行渔业养殖近40年，当前仍在养殖.4个养殖塘均以鳙鱼（Aristichthysnobilis）、鲢鱼（Hypophthalmichthysmolitrix）和草鱼（Ctenopharyngodonidella）为主要养殖品种.

自然湖泊N1~N4采样点中采集水体W1~W4，以NW命名，沉积物S1~S4，以NS命名.养殖塘F1~F4采样点中采集水体W5~W8，以FW命名，沉积物S5~S8，以FS命名.且每一个采样点均由3个混合样混合，共采集了24个水体样品和24个沉积物样品.

水体采样利用采样器在水面下5~15cm左右采集进500mL聚乙烯无菌瓶中.一部分水样瓶中注入约0.2mL稀H2SO4溶液以抑制微生物活性，用来测定部分水体理化性质。

另一部分（1L）先后过5μm的微孔无菌滤膜以除去大的颗粒杂物，再用0.22μm的微孔无菌滤膜以收集微生物细胞，并存放于无菌培养皿中密封后置于?18℃的冰箱中冻存用于后续的高通量测序分析.

沉积物样品采用抓斗式底泥采样器采集，用聚乙烯塑料袋密封编号，并在装有冰袋的冷藏箱临时存储，然后带回实验室.沉积物样品分为2份，一份进行自然风干用于理化性质分析；另一份挑出杂物后直接冷冻干燥，用于细菌高通量测序分析.

粒度采用贝克曼COULTERLS230型激光粒度分析仪进行测定；总氮（TN）、总硫（S）、C/N采用德国Elementar公司生产的VarioMACROCHNS元素分析仪测定.研究区水体和沉积物样品基本理化性质见表1和表2.水体和沉积物环境质量评价采用单因子评价方法。

NA提取后分别采用0.8%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度检测DNA提取质量和浓度.采用NEB公司的Q5高保真DNA聚合酶进行PCR扩增，应用AXYGEN公司的凝胶回收试剂盒对PCR扩增产物回收。

采用荧光试剂为Quant-iTPicoGreendsDNAAssayKit进行PCR扩增回收产物荧光定量分析，然后通过qiimedada2denoise-paired调用DADA2进行质控、去噪、拼接、去嵌合体。

以上步骤针对每个文库分别进行分析.完成对所有文库的去噪后，合并ASVs特征序列和ASVs表格，并去除singletonsASVs.

采用SPSS26.0对数据进行ANOVA分析；应用Origin2019绘制柱状图、折线图与生态网络P散点图；应用CANOCO5.0基于DCA<3.0，选择冗余分析（RDA）来评估细菌群落与环境因子间的关系。

使用FAPROTAX对细菌群落功能进行预测应用Manteltest分析检验相关性及其显著性水平，基于Bray-Curtis距离进行NMDS分析，并采用相似度分析（ANOSIM）来评估不同组间细菌群落的差异性.以上结果绘图在R语言（R.4.1.2）中完成.

采用随机矩阵原理构建不同环境样品细菌共现网络，根据模块内连接度（Zi）和模块间连接度（Pi）确定各ASV的拓扑作用，识别模块枢纽，连接节点和网络枢纽：Zi≥2.5的ASVs被视为模块枢纽，Pi≥0.62的ASVs被视为网络中的连接节点。

同时满足这两个条件的被视为网络枢纽，模块枢纽表明模块内物种间相互作用较大；连接节点表明模块间物种间相互作用较强。

为确保在同等或极为相近的条件下进行网络分析，采用0.86的阈值来构建自然湖泊水体（NW）、养殖塘水体（FW）2个网络。

采用0.92的阈值来构建自然湖泊沉积物（NS）、养殖塘沉积物（FS）2个网络，最后利用Gephi0.9.2软件将结果可视化.

?——【·结果与分析·】——?

门分类水平上，养殖塘水体和沉积物细菌群落组成与自然水体及沉积物存在一定差异（图2）.水体中放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）为优势菌门，占比共计91.60%~94.41%。

沉积物中变形菌门、绿弯菌门（Chloroflexi）为优势菌门，占比共计49.80%~52.36%。

相对于NW，FW中绿弯菌门、疣微菌门（Verrucomicrobia）、蓝细菌门（Cyanobacteria）和酸杆菌门（Acidobacteria）相对丰度显著降低，而放线菌门与螺旋体菌门（Spirochaetes）相对丰度显著升高.

与NS相比，FS中变形菌门、酸杆菌门、硝化螺旋菌门（Nitrospirae）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）相对丰度显著低降低，而拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、蓝细菌门（Cyanobacteria）、硝化刺菌门（Nitrospinae）相对丰度显著升高。

纲水平分类上，FW中γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）、产氧光细菌纲（Oxyphotobacteria）相对丰度显著低于NW，而放线菌纲（Actinobacteria）、钩端螺旋体菌纲（Leptospirae）、梭菌纲（Clostridia）相对丰度显著高于NW（图3）。

FS中α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）、酸杆菌纲（Acidobacteriia）、芽单胞菌纲（Gemmatimonadetes）及γ-变形菌纲相对丰度含量显著低于NS。

而拟杆菌纲（Bacteroidia）、梭菌纲、δ-变形菌纲（Deltaproteobacteria）及红蝽菌纲（Coriobacteriia）相对丰度显著高于NS.以上结果表明渔业养殖改变了研究区水体和沉积物细菌群落组成

NMDS分析结果显示水体和沉积物各样点细菌群落组成按养殖塘与自然湖泊分别聚类，但沉积物细菌群落差异更为明显（图4）。

聚类结果的ANOSIM分析进一步表明，无论水体和沉积物，养殖塘和自然湖泊聚类结果都具有极显著性（p<0.01），反映出渔业养殖显著改变了水体和沉积物细菌群落结构.

多样性指数是各种环境细菌种类丰富程度的重要指标.除水体细菌Observedspecies和Simpson指数外，养殖塘水体细菌其他多样性指数和沉积物细菌多样性指数均显著低于自然湖泊（p<0.05），其中沉积物细菌Chao1、Observedspecies、Pielou、Shannon和Simpson指数达到了极显著差异水平（p<0.01）（图5）.

总体上，渔业养殖显著降低了水体和沉积物细菌多样性研究区水体和沉积物细菌共现网络节点按门水平（节点总数≥10）着色下，NW和FW网络中共发生的物种数均为4个，而FS比NS多2个，为11个（图6）.

相对于NW，FW变形菌门节点数明显减少，而FW放线菌门节点数明显升高；FS变形菌门和酸杆菌门节点数较NS明显降低，但绿弯菌门、拟杆菌门和硝化螺旋菌门节点数量明显升高，且出现了厚壁菌门.节点按模块着色下（节点总数≥10），共发生网络中NW和FW大部分的节点被分别划分为8个和3个模块，

NS与FS分别为16个与12个模块，其中NW与FW中共有模块节点占比为40.43%，而NS和FS只有24.93%.NW的8个主要模块节点占网络节点的76.90%。

FW的3个主要模块节点占网络节点的91.24%；NS的16个主要模块节点占网络节点的80.79%，FS的12个主要模块节点占网络节点的66.62%。

以上所述表明，渔业养殖不仅导致构成水体和沉积物细菌分子生态网络的物种发生改变，也促使了细菌分子生态网络间更加聚集.

在门水平上构建的经验性MEN与随机MENs结果显示细菌分子生态网络特征参数基本相近（表3）。

研究区FW细菌网络的连接数、平均连接度和平均聚类系数均高于NW，平均路径距离与模块化指数均低于NW.FS细菌网络的节点数、连接数和平均连接度均高于NS，平均聚类系数、平均路径距离与模块化指数均低于NS.表明相对于自然湖泊。

养殖塘水体和沉积物细菌生态网络更加集聚，模块内不同种群细菌间联系更为紧密.其中，NW细菌分子生态网络以正相关连接为主。

但FW则以负相关连接为主；沉积物细菌分子生态网络均以正相关连接为主，且FS（63.99%）高于NS（54.72%）.在模拟部分节点被破坏（移除）时，自然湖泊水体和沉积物细菌网络鲁棒性高于养殖塘（图7）。

分子生态网络特征参数进一步说明渔业养殖促使水体和沉积物细菌种群间模块内的联系更加紧密，也改变了细菌种群间联系的性质，降低了细菌分子生态网络的稳定性

NW细菌网络拥有3个模块枢纽节点（ASV208101、ASV418495等），均属于变形菌门；9个连接节点（ASV69315、ASV326183等），分别属于放线菌门（5个）、变形菌门（2个）、绿弯菌门与拟杆菌门（各1个）（图8a）.FW拥有5个模块枢纽节点（ASV218448、ASV291691等），分别属于放线菌门（4个）、绿弯菌门（1个）。

2个连接节点（ASV491819和ASV261302），均为变形菌门.FW关键节点总数比NW少4个，主要关键物种由变形菌门（5个）和放线菌门（5个）转为放线菌门（4个）.NS有24个模块枢纽节点（ASV389844、ASV11402、ASV262458等）。

分别属于变形菌门（9个）、酸杆菌门（4个）、硝化螺旋菌门与放线菌门（各3个）、绿弯菌门（2个）、厚壁菌门、拟杆菌门及芽单胞菌门（各1个）；1个连接节点（ASV411318），属于绿弯菌门（图8b）。

FS有19个模块枢纽节点（ASV88292、ASV94688、ASV432471等），分别属于绿弯菌门（8个）、变形菌门（5个）、硝化螺旋菌门、棒状杆菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门和酸杆菌门（各1个）；1个连接节点（ASV365678），为硝化螺旋菌门.FS关键节点总数比NS少5个，主要关键物种由变形菌门（9个）转化为绿弯菌门（8个）.

NW与FW中不存在相同的关键物种节点，而沉积物中只有ASV334064（pChloroflexi；cAnaerolineae）在NS与FS中均出现.总体上，渔业养殖后水体和沉积物细菌分子生态网络关键节点总数降低了，构建分子生态网络的关键物种也发生改变.

FAPROTAX功能预测结果显示水体中共有43类功能，沉积物中共62类功能.FW中光异养（photoheterotrophy）、光营养（phototrophy）相对丰度显著显著低于NW，而动物寄生虫或共生动物（animalparasitesorsymbionts）。

与人相关的（humanassociated）、人类肠道（humangut）、哺乳动物肠道（mammalgut）、人类病原体感染（humanpathogensnosocomia）与人类病原体败血症（humanpathogenssepticemia）相对丰度显著高于NW（图9）.

FS中硝化作用、好氧化学异养、好氧亚硝酸盐氧化、固氮、捕食性或寄生性等功能相对丰度显著低于NS，而发酵、铁呼吸、含硫化合物的呼吸、硫酸盐呼吸、亚硫酸盐呼吸等与硫循环相关的功能相对丰度显著高于NS（图9）.

FAPROTAX功能预测中各功能所含ASVs与网络分析中各模块所含ASVs比对结果显示，NW网络模块各节点主要参与了化学异养、好氧化学异养和甲醇氧化功能。

而FW为化学异养、好氧化学异养、胞内寄生虫功能.NS网络模块各节点主要参与了化学异养、好氧化学异养和甲基营养功能。

而FS中以化学异养、铁呼吸、含硫化合物的呼吸、硫酸盐呼吸（13个）为主.其中，NW模块0、1、2可能主要参与了化学异养、甲醇氧化与发酵功能。

而FW模块2可能主要发挥着胞内寄生虫功能.FS模块0、1、2可能主要参与铁呼吸、含硫化合物的呼吸、硫酸盐呼吸功能。

而NS中只有模块54可能参与了铁呼吸功能，且较少模块涉及与硫循环有关功能.分子生态网络关键物种节点与FAPROTAX各功能节点比对发现，NW模块4中枢纽节点ASV418495、模块3中枢纽节点ASV208101主要参与好氧化学异养、化学异养、发酵、光异养、光营养功能。

NS模块1中枢纽节点ASV389844参与了好氧化学异养、硝化作用功能；模块10中枢纽节点ASV11402参与化学异养与发酵功能；模块8中枢纽节点ASV262458参与了含硫化合物的呼吸与硫酸盐呼吸功能.而FW和FS关键节点与FAPROTAX各功能节点无重合，也尚不清楚这些关键节点发挥着哪些重要的功能.

总体上，渔业养殖影响分子生态网络关键节点与功能潜势关键节点间的关联性，也改变了水体和沉积物功能潜势.水体细菌光营养功能潜势降低，而动物疾病相关的功能潜势增加，沉积物细菌氮循环功能潜势降低，而细菌硫循环功能潜势增加.

细菌群落结构上RDA分析结果与NMDS分析结果相似，渔业养殖下水体和沉积物细菌群落结构与自然湖泊存在明显差异.RDA分析进一步表明pH是影响研究区水体细菌群落结构的最主要解释因子，累积解释量为17.5%（p=0.012），而EC和TP分别为9.4%和9.0%（p<0.05）.

沉积物环境中除粘粒外，其他土壤因子的解释量均达到了显著水平（p<0.05），AP、S、TP、AN、TN和C/N的单独解释量分别为40.3%、37.7%、37.0%、27.9%、22.5%和14.3%（p<0.05），其中AP、C/N和S的累积解释量分别为40.3%、15.0%和13.0%（p=0.002）（图10b）

本研究区除养殖塘水体pH显著高于自然湖泊外，其他所测水体理化性质指标未有显著性差异，但沉积物有效氮、全磷、有效磷和硫含量均显著高于自然湖泊.

水体和沉积物pH、COD、氮、磷和硫化物等物理化学性质影响着细菌群落组成，有研究表明污水排放可导致河流沉积物δ-变形菌纲和厚壁菌门增加，而γ-变形菌纲和疣微菌门降低.

?——【·结论·】——?

渔业养殖显著改变了水体和沉积物细菌群落结构，偏好富营养和耐污染环境的厚壁菌门、放线菌门和拟杆菌门相对丰度提升，水体中如螺旋体门类病原菌相对丰度也升高.同时养殖塘水体和沉积物细菌多样性降低，表明养殖塘环境细菌群落结构稳定性下降.

渔业养殖提高了水体和沉积物细菌分子生态网络的连接数和平均连接度，但降低了平均路径距离、模块化指数、关键节点数和鲁棒性.养殖塘环境细菌分子生态网络的复杂性和稳定性降低，进一步表明养殖塘环境细菌群落结构稳定性的下降.

渔业养殖后养殖塘水体和沉积物细菌群落结构和分子生态网络关键物种的更变，促使养殖塘环境细菌的生态功能发生变化.水体细菌光营养功能潜势降低，动物疾病相关的功能潜势增加；沉积物细菌氮循环功能潜势降低，而细菌硫循环功能潜势增加.

养殖塘环境细菌群落结构稳定性降低和功能潜势变化，尤其病原菌细菌丰度提高，启示人们在渔业养殖过程中应减少过量营养物质和化学药剂输入，以减少对养殖塘环境微生物的影响，有利于构建健康、绿色和生态系统稳定的水产养殖环境.