《食品科学》：东北农业大学陈倩教授、秦立刚副教授等：适度氧化的肌原纤维蛋白与醛类化合物相互作用及机制

肉制品的风味会直接影响消费者的接受程度。肌肉蛋白作为肉及肉制品的主要成分之一，对肉制品的风味形成有重要的影响。肌原纤维蛋白（MPs）作为肌肉蛋白的重要组成成分，约占肌肉蛋白总量的55%～65%，在肉制品加工特性及品质特性等方面起着至关重要的作用。 蛋白质氧化对肉制品品质具有双面性的影响，其对风味形成的影响可表现为以下2 个方面：一是对风味物质产生的影响；二是对风味物质结合的影响。

鉴于此，东北农业大学食品学院的代欣欣、陈倩*和动物科学技术学院的秦立刚*等建立羟自由基氧化体系 ，本研究建立羟自由基氧化体系（0.1 mmol/L FeCl 3 ，0.1 mmol/L抗坏血酸，H 2 O 2 浓度分别选择0、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0、10 mmol/L和25 mmol/L），研究不同氧化程度对MPs与4 种典型醛类化合物（3-甲基丁醛、戊醛、己醛和庚醛）相互作用的影响及机制。采用气相色谱-质谱（GC-MS）联用技术对MPs与醛类的结合能力进行测定，并采用紫外光谱、荧光光谱、荧光猝灭分析、热力学分析、同步荧光光谱和圆二色谱对氧化的MPs与醛类的作用机制进行分析，以期为肉制品的风味调控提供理论基础和技术指导。

1 结合能力分析

如图1所示，不含蛋白的空白组中风味化合物的顶空含量为100%，当顶空含量小于100%时，则表示蛋白对风味化合物有相互作用。风味化合物的顶空含量越小，表明蛋白对其的结合能力越强。对照组中3-甲基丁醛、戊醛、己醛和庚醛的顶空含量均小于100%，表明MPs对它们均有结合能力，并且MPs对醛类的结合能力随碳链长度的增加而增大，庚醛＞己醛＞戊醛＝3-甲基丁醛。在4 种醛类中，庚醛与MPs的结合能力最强，3-甲基丁醛和戊醛与MPs的结合能力没有显著性差异，这是由于3-甲基丁醛（1.08×10 -2 ）的空气/水分配系数相对低于戊醛（1.31×10 -2 ），更容易在水相中结合蛋白质，而3-甲基丁醛又表现出空间位阻效应，会阻止其与蛋白质结合，这些原因相互作用下使得3-甲基丁醛和戊醛与MPs的结合能力没有显著性差异。另外，随着氧化程度的增加，除了3-甲基丁醛，3 种醛类的顶空含量均呈现先降低后增加的趋势，表明戊醛、己醛和庚醛与MPs的结合能力先增加后降低，并在1.0 mmol/L H 2 O 2 氧化处理时MPs与4 种醛的结合能力达到最大。低氧化程度下（H2O2≤1.0 mmol/L），MPs对4 种醛的结合能力随着氧化程度的增加而增强。然而，高氧化程度下（H2O2≥1.0 mmol/L），随着氧化程度的加深MPs与4 种醛的结合能力降低，可能是由于过度的氧化使蛋白质发生聚集，阻碍了MPs与4 种醛的结合。

2 紫外光谱分析

由2.1节中结合能力分析结果可知，H2O2浓度为1.0 mmol/L时MPs结合4 种醛类的能力最强，因此后续相互作用机制研究均采用1.0 mmol/L H2O2氧化处理MPs。紫外光谱是一种用来研究蛋白质结构变化的有效方法，其谱图变化可以用来衡量生物分子之间是否发生了相互作用。由图2可知，MPs在波长208 nm和280 nm附近有2 个特征吸收峰。208 nm的峰源于蛋白质内部的肽键，280 nm的峰源于蛋白质内部的芳香族氨基残基。经预实验可知，4 种醛类在200～400 nm范围均没有明显的吸收峰。随着醛类质量浓度增加，MPs在波长208 nm附近的吸收峰发生了波动，说明4 种醛类均改变了MPs的构象，即4 种醛类与MPs发生了相互作用。然而，MPs在波长280 nm附近的吸收峰没有明显改变，表明4 种醛类与MPs未形成稳态复合物，即其与MPs发生了动态猝灭。

3 荧光光谱分析

荧光光谱法被广泛应用于研究蛋白与小分子的相互作用，可以反映蛋白质的三级结构变化情况。如图3所示，MPs的发射荧光强度在波长340 nm附近达到最大值，且随着4 种醛类质量浓度的增加，MPs的发射荧光强度呈现降低的趋势。经过预实验得知，4 种醛类均无荧光强度，这一结果表明4 种醛类猝灭了MPs的荧光，MPs与4 种醛类之间发生了相互作用。随着3-甲硫基丙醛添加量的增大，MPs的荧光强度逐渐减弱。

4 荧光猝灭分析

由上一节荧光光谱分析可知，4 种醛类猝灭了MPs的固有荧光，因此利用Stern-Volmer方程进一步探索猝灭的机制。如图4所示，4 条曲线都呈现良好的线性关系，3-甲基丁醛、戊醛、己醛和庚醛的拟合优度分别为0.993 2、0.970 7、0.981 7和0.985 1。如表1所示，Stern-Volmer方程的斜率为猝灭常数K sv ，经计算3-甲基丁醛、戊醛、己醛和庚醛的K sv 分别为1.15×10 3 、1.37×103、1.64×103L/mol和2.75×103 L/mol。通过Ksv进一步计算可得到猝灭速率常数K q ，3-甲基丁醛、戊醛、己醛和庚醛分别为1.15×10 11 、1.37×1011、1.64×1011 L/（mol•s）和2.75×1011 L/（mol•s），均远大于生物大分子的最大动态扩散猝灭常数2×1011 L/（mol•s），表明这4 种醛类引发的MPs荧光猝灭是静态猝灭。结合2.2节紫外光谱结果可知，4 种醛类与MPs发生了动态猝灭，加之荧光猝灭分析，说明4 种醛类与MPs的相互作用是静态猝灭和动态猝灭相结合的作用机制。

5 热力学分析

4 种醛类与MPs的相互作用机制相同，且庚醛与MPs的结合能力最强，因此后续以庚醛为代表，对其与MPs相互作用机制进行进一步探究。在发生静态猝灭的情况下，当小分子独立地与蛋白质上一组等效位点结合时，其结合常数（K a ）和结合位点数（n）可通过Stern-Volmer改进方程获得，本实验改进方程如图5所示。由表2可知，在3 个温度条件下的n值约为1，K a 保持在10 4 L/mol的量级范围内，这说明MPs与庚醛的亲和力适中。

小分子配体通过4 种结合模式与生物大分子结合，分别是范德华力、疏水相互作用、氢键和静电相互作用，这4 种结合模式可通过热力学分析中的焓变ΔH和熵变ΔS值进行区分：1）当ΔH＞0和ΔS＞0时为疏水相互作用；2）当ΔH＜0和ΔS＜0时为范德华力和氢键；3）当ΔH＜0和ΔS＞0时为静电相互作用。对于较小的温度变化，ΔH可被视为常数，并可根据lnK与1/T的曲线斜率计算。由表3可知，ΔG＜0表明MPs和庚醛之间的相互作用是自发的。此外，ΔH＞0和ΔS＞0还表明MPs与庚醛之间的相互作用靠疏水相互作用驱动。

6 同步荧光光谱分析

蛋白质固有荧光的变化可以反映荧光团周围微环境的变化，而Tyr和Trp残基对其所处微环境极为敏感，Δλ＝15 nm和Δλ＝60 nm分别代表Tyr和Trp残基的光谱特征。在同步荧光光谱中，峰的红移表示荧光团所处的微环境极性增强，疏水性减弱；蓝移表示微环境疏水性增强，极性减弱。由图6可知，随着庚醛质量浓度的增加，Tyr和Trp残基的最大吸收峰均发生红移，表明MPs的Tyr和Trp残基暴露在更亲水的环境中。也就是说，Tyr和Trp残基周围的微环境极性增加，疏水性减弱。MPs中与庚醛结合的位置可能在Tyr和Trp残基附近。基于以上分析，推测庚醛与MPs的结合会影响MPs的构象。

7 圆二色谱分析

采用圆二色谱进一步分析4 种醛类对MPs构象的影响，经1.0 mmol/L H 2 O 2 氧化处理的MPs与4 种醛类作用后的圆二色谱如图7所示。MPs的圆二光谱在208 nm和222 nm处有2 个负峰，这是α-螺旋结构中肽键的n-π * 跃迁所致。

添加4 种醛类后MPs的圆二色谱呈现相同的变化趋势，以庚醛为例计算MPs中二级结构的变化情况。如表4所示，随着庚醛质量浓度的增加， α -螺旋相对含量从19.24%下降至16.88%， β -折叠相对含量从24.59%增加至26.47%，说明MPs的结构由有序状态向无序状态转变。 α -螺旋相对含量的减少说明庚醛能与MPs中的氨基酸残基相互作用，破坏氢键（包括分子内氢键）；此外， α -螺旋相对含量的减少可能使MPs内部的疏水性基团暴露，这一结果与同步荧光光谱结果（红移）相一致。总体而言，MPs与庚醛的相互作用改变了MPs的二级结构。

结 论

本研究建立了羟自由基氧化体系，探究不同氧化程度的MPs与3-甲基丁醛、戊醛、己醛和庚醛的相互作用。结果表明，庚醛与MPs的结合能力最强，且H2O2浓度为1.0 mmol/L时MPs与4 种醛类结合能力最强，说明适度氧化可以促进MPs与醛类化合物的相互作用，热力学分析进一步揭示了疏水相互作用是维持两者结合的主要驱动力。紫外光谱及荧光光谱分析表明，醛类通过静态和动态猝灭相结合的机制猝灭MPs的荧光；同步荧光光谱特征峰的红移和α-螺旋相对含量的降低进一步证实了MPs中的氨基酸残基与醛类发生了相互作用。本研究从分子水平揭示了MPs与醛的相互作用机制，为肉制品的风味调控提供了理论基础及技术支持。

本文《适度氧化的肌原纤维蛋白与醛类化合物相互作用及机制》来源于《食品科学》2023年44卷18期1-8页. 作者：代欣欣，吕懿超，殷小钰，窦庆哲，孔保华，陈倩，秦立刚. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20221114-162. 点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：李雄；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。