Cell Stem Cell：陈水冰团队利用胰腺癌类器官平台发现特异性靶向突变KRAS的抑制剂

2023年12月26日，美国康奈尔医学院陈水冰教授、Todd Evans教授团队在Cell Stem Cell期刊发表了题为：A Pancreatic Cancer Organoid Platform Identifies an Inhibitor Specific to Mutant KRAS 的研究论文。

该研究成功利用等基因胰腺类器官平台进行了高通量药物筛选研究，最终鉴定出了 小分子候选药物Perhexiline maleate，它可以在体外和体内抑制携带KRAS突变的胰腺类器官以及原代人胰腺导管腺癌类器官的生长并诱导细胞凋亡。同时他们发现胆固醇合成在KRAS突变类器官中特异性上调， Perhexiline maleate可以降低SREBP2表达水平，从而发挥对KRAS 突变体的抑制作用。这项研究为筛选胰腺癌的靶向抑制剂提供了强大的研究工具。

胰腺导管腺癌（PDAC） 有着“癌王”之称。因缺乏特异的筛查和诊断指标，许多患者在发现之初就已经失去了手术的机会。大规模基因组研究发现超过90%的PDAC存在KRAS驱动突变。突变的KRAS与胰腺肿瘤的增殖、迁移、转化、存活、逃避肿瘤免疫以及细胞代谢重编程都存在密切联系。在PDAC中，KRAS蛋白的12号氨基端是最常受累的突变位点，其中以KRAS G12D 突变类型最为常见，其次是KRAS G12V 。

长期以来，肿瘤驱动基因KRAS一直被认为是“不可成药”靶点，直到最近几款针对KRAS G12C 突变的特异性抑制剂的研发，这一领域才迎来突破性进展，包括AMG510（sotorasib）、MRTX849（adagrasib）、MTRX1257、ARS-853和ARS1620。在这些药物中，AMG510和MRTX849已获批临床使用，显示对非小细胞肺癌患者有一定疗效作用，但反应有限且很快产生耐药性，中位无进展生存期分别约为6-11个月。与KRAS G12C 相比，针对KRAS G12D 或KRAS G12V 的可选择药物则更加有限。其中仅有选择性靶向KRAS G12D 的MRTX1133进入1期临床实验。

除此之外，科学家发明了新的靶向策略，选择性共价抑制剂通过与激活状态的KRAS以及亲环素A之间形成稳定的、高亲和力的三复合物，从而干扰KRAS与RAF激酶等下游效应蛋白的相互作用。采用这一策略的共价抑制剂有KRAS multi （RMC 6236） 、KRAS G12C （RMC 6291） 、KRAS G12D （RMC 9805） 和 KRAS G13D （RMC 8839） 。其中，RMC 6236（NCT05379985）和 RMC 6291（NCT05462717）已进入1期临床试验。然而，这些候选药物都尚未使用等基因癌症模型进行验证。

在这项研究中，研究团队利用类器官培养技术与CRISPR-Cas9基因编辑技术相结合，在实验室构建了一套等基因胰腺类器官平台：野生型胰腺类器官 (WT)；Pdx1-Cre，KrasLSL-G12D/+ 类器官 (KC)；Pdx1-Cre，KrasLSL-G12D/+，Tp53LSL-R172H/+ 类器官 (KPC)；Pdx1-Cre，KrasLSL-G12D/+，Smad4-/- (KSC) 与 Pdx1-Cre，KrasLSL-G12D/+，Tp53LSL-R172H/+，Smad4-/- (KPSC)。并利用多重单细胞RNA-seq （multiplexing scRNA-seq） 技术对这些类器官的转录组进行了表征，以监测胰腺癌驱动突变引起的转录变化。通过无监督数据分析和条形码投影识别的细胞簇匹配良好，这表明细胞簇的基因特征主要受基因型影响。

接下来，他们研究了胰腺细胞谱系的转录因子谱，包括导管谱系、外分泌谱系（腺泡）和内分泌谱系。结果表明胰腺癌类器官主要表达胰腺导管细胞标记基因。除此之外，为了在单细胞水平上阐明肿瘤分子亚型，利用SCENIC同时重建基因调控网络并识别 KSC、KPC和KPSC细胞状态。结果显示在KSC类器官中鉴定出类似基底细胞亚型（basal-like）的调节子（regulons），包括 Myc、Est1、Hmga2 和 Zeb1 。以往的研究表明，Gata6表达与PDAC中的经典亚型（classical）相关。他们的研究结果也表明 Gata6、Sox9、Hnf1b 和 Onecut2 是KPC和KPSC类器官中的主要表达的regulons。然而，一些basal-like regulons，包括 Nr3c1、Mxi1、Taf1、Klf7、Fosl1 ，也可以在KPC和KPSC类器官中表达。因此，basal-like和classical两种分子亚型的表达特征可以在KPC和KPSC类器官中共存，这就赋予它们潜在的细胞可塑性。

随后，为了识别靶向KRAS G12D 突变的小分子抑制剂，研究团队利用上述平台筛选了约 6000种化合物，包括FDA批准的药物、信号通路抑制剂和天然产物库等。经过几轮筛选与验证，最终聚焦在了Perhexiline maleate这一小分子上。体外实验表明Perhexiline maleate可以有效KC、KPC、KSC和KPSC类器官细胞生长，而WT类器官生长影响较小。体内原位移植瘤药效评价模型也表明Perhexiline maleate可抑制肿瘤生长，同时与FOLFIRINOX有一定联合治疗效果。

Perhexilinemaleate 诱导人胰腺癌类器官的细胞死亡，红色为细胞死亡标记

接下来，研究团队在人源胰腺癌类器官、大肠癌类器官、肺癌类器官对Perhexiline maleate的抗肿瘤作用进行了测试。结果表明Perhexiline maleate可以抑制携带KRAS G12V 突变的胰腺癌类器官WCM744和WCM773的活力。除此之外，对于两种携带KRAS G12D 突变的WCM2326和WCM2171 PDAC类器官，Perhexiline maleate也表现出类似的抑制作用。

随后，他们探讨了Perhexiline maleate对具有不同KRAS状态的大肠癌类器官的影响，包括KRAS WT （WCM392）、KRAS G12D （WCM1403）和KRAS G12C （WCM1050）。同样，他们评估了其对携带KRAS G12C （WCM1712）、KRAS G12D （WCM2332）和 KRAS G12V （WCM2363）突变的肺癌类器官的影响。研究结果表明Perhexiline maleate 可以抑制不同KRAS突变的多种癌症类器官，而与KRAS WT 类器官相比，Perhexiline maleate对KRAS G12D 、KRAS G12V 和KRAS G12C 癌症类器官表现出较低的IC50。这些结果表明Perhexiline maleate可以特异性地针对多种KRAS突变类型，而且KRAS WT 影响较小。

通过对机制的探讨，研究团队发现，突变的KRAS可以活化下游PI3K/AKT/mTOR通路，激活胆固醇生物合成途径，从而促进致癌信号传导和肿瘤进展。而这条通路可以特异性被Perhexiline maleate所抑制。由于Srebf2基因编码的甾醇调节元件结合蛋白2（SREBP2）通过控制参与胆固醇合成和摄取的酶来调节胆固醇稳态。SREBP2增强胆固醇生物合成基因的表达，为癌细胞提供生长优势，是胶质母细胞瘤、结肠癌和肝细胞癌等癌症的主要驱动因素， 因此，他们研究了Perhexiline maleate是否是通过调节SREBP2介导的胆固醇生物合成来发挥抗肿瘤作用。结果表明Perhexiline maleate抑制KPSC类器官中Srebf2的转录水平，同时可以抑制胆固醇合成和摄取相关基因相关，包括 Ldlr、Hmgcs1、Hmgcr、Mvd、Fdps 等。接下来他们利用遗传学手段与化学小分子对SREBP2进行干扰，结果均表明SREBP2是胰腺癌治疗的潜在靶点。

综上，致癌KRAS突变激活SREBP2，导致胆固醇代谢发生重编程。积累的胆固醇反过来又通过提供能量和抵抗细胞凋亡来促进肿瘤生长。Perhexiline maleate通过降低SREBP2表达水平，逆转致癌KRAS诱导的代谢重编程，并最终抑制携带KRAS突变的胰腺癌类器官的生长。

综上所述，该研究首次利用等基因胰腺类器官平台进行了高通量药物筛选研究，最终鉴定出了小分子候选药物Perhexiline maleate，它可以在体外和体内抑制携带KRAS突变的胰腺类器官以及原代人PDAC类器官的生长并诱导细胞凋亡。同时他们还发现胆固醇合成在KRAS突变类器官中特异性上调， Perhexiline maleate可以降低SREBP2表达水平，从而发挥对KRAS突变体的抑制作用。

威尔康奈尔医学院Fong Cheng Pan博士、陈水冰教授与Todd Evans教授为该论文通讯作者。康奈尔医学院段晓华博士、张拓博士和华中师范大学冯玲玲教授论文共同第一作者。

论文链接：

https://doi.org/10.1016/j.stem.2023.11.011