FSHW | 安络小皮伞发酵液多糖的羧甲基化及其抗抑郁机制

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Introduction

现代社会给人们带来的压力逐渐增大，随之而来的是沉重的精神负担，这使得抑郁症成为城市生活中一种更常见的精神疾病。安络小皮伞（Marasmius Androsaceus）作为食用菌，在前期的研究中表明，胞外多糖（MEPS）具有较好的抗抑郁作用。此外，通过分离纯化得到MEPS2，并对MEPS2的结构和抗抑郁机制进行了分析。结果表明，MEPS2具有抗抑郁作用，其抗抑郁作用主要与儿茶酚胺类神经递质（多巴胺，肾上腺素，去甲肾上腺素及其衍生物）系统有关，在TH、D2DR和CaMKII有特异性位点。

天然多糖的化学性质和生物活性可以通过分子修饰来改变。该方法不仅丰富了多糖的结构类型，而且为筛选高活性或特异性多糖提供了更多的选择，更好地解释了多糖的构效关系。因此，天津科技大学的邱瑜、苏艳等同学以及宋佳副教授、王敏教授等人在前人工作的基础上，采用化学方法对MEPS2进行羧甲基化修饰，制备出羧甲基化的MEPS2多糖。以PC12细胞培养上清液中神经递质含量为指标，筛选出抗抑郁效果最好的羧甲基多糖（C-MEPS2）。采用元素分析和扫描电子显微镜对C-MEPS2进行了表征。从细胞和动物水平进一步探讨了C-MEPS2的抗抑郁机制。此外，用单胺类神经递质对实验结果进行了验证，并利用它们在相关消耗品和拮抗剂代谢途径中的受体进行了联合给药实验。

Results and Discussion

羧甲基多糖抗抑郁活性的筛选与表征

选择了在40 ℃下反应3 h制备的C-MEPS2对PC12-H细胞单胺类递质及其受体的改善作用最为显著的进行了研究。对其表征发现与MEPS2相比，C-MEPS2的O、H元素的摩尔比增大，在一定程度上说明了羧甲基改性的成功。扫描电镜发现改性后的多糖结构致密、分布均匀、规则。这种现象可能是由于分子修饰引起多糖分子结构的改变，从而导致其外部形态发生变化。

羧甲基多糖对PC12-H抗抑郁作用的分析

根据荧光显微镜观察的结果研究发现130 μg/mL MEPS2与C-MEPS2的最佳恢复效果与对照组无显著差异，C-MEPS2的作用比MEPS2更明显，因此选择该浓度进行后续研究。JC-1染色结果所示20 μg/mL RES组与对照组相比，130 μg/mL MEPS2和C-MEPS2处理后可显著提高线粒体膜电位，恢复受损细胞。C-MEPS2组恢复效果优于MEPS2组。Fluo-4AM染色和荧光显微镜显示与模型组相比，130 mg/mL MEPS2或C-MEPS2处理的绿色荧光强度明显低于模型组，说明能显著降低细胞内Ca 2+ 浓度，恢复受损细胞。

Western blot结果显示130 mg/kg MEPS2或C-MEPS2处理后，TH表达水平分别增加（27±2.36）%和（47.3±4.63）%。D2DR的表达水平较模型组显著升高（（30.3±5.13）%和（37.5±2.68）%），细胞周期蛋白激酶Ⅱ磷酸化水平分别升高（36.21±1.21）%和（49.52±3.01）%。所有结果与模型组相比均有显著性且C-MEPS2的作用优于MEPS2。

图1 PC12-H中TH、D2DR、P-CAMKⅡ磷酸化表达水平

羧甲基多糖对小鼠抗抑郁作用的分析

FST和TST的分析结果表明，与对照组相比，MEPS2和C-MEPS2均能缩短小鼠的不动时间，且C-MEPS2的作用明显优于MEPS2。但与MEPS2相比，C-MEPS2能显著缩短小鼠游泳不动时间，但尾部悬吊时间变化不大。因此，FST被选择用于后续的机制验证研究。C-MEPS2可显著缩短小鼠在FST的不动时间。C-MEPS2与AMPT（300 mg/kg）或雷氯普利（0.2 mg/kg）共处理，不变时间分别增加9.20%和15.43%。

图2 C-MEPS2对小鼠抗抑郁作用的研究

Conclusion

在细胞水平上，筛选了MEPS2和羧甲基多糖的抗抑郁作用。MEPS2和羧甲基多糖可以增加CA、NE和DA的浓度，上调P-CAMKⅡ和D2DR的表达，且取代度为1.113±0.009。MEPS2和C-MEPS2可以稳定线粒体膜电位和细胞内Ca2+浓度，缓解RES引起的细胞凋亡。C-MEPS2的效果优于MEPS2，这与羧甲基的引入有关。此外，动物实验进一步证明，C-MEPS2发挥的抗抑郁作用与儿茶酚胺的合成有关，其具体部位为TH、D2DR和P-CAMKⅡ。这些数据可以为C-MEPS2作为一种有效的抗抑郁产品的临床应用提供新的思路。

图3 C-MEPS2的抗抑郁活性机制

第一作者

邱瑜，女，现为天津科技大学生物工程学院系统微生物与生物制造工程实验室的硕士研究生，研究的方向为工业微生物相关及其多糖的结构与性质。获得2020-2021 二等新生学业奖学金以及2021-2022 校级二等奖学金。

通信作者

王敏，女，博士，教授，博士生导师，天津科技大学研究生院常务副院长，国家“万人计划”科技创新领军人才，科技部中青年科技创新领军人才，教育部新世纪优秀人才，天津市杰出津门学者、天津市131创新型人才培养工程第一层次人选，天津市工业微生物与发酵技术创新团队带头人，国务院学位委员会轻工技术与工程学科评议组委员，国务院特贴专家。中国调味品协会科学技术委员会副主任委员，中国粮油学报、食品与发酵工业、中国酿造等期刊编委。

主要从事具有重要食品与医药价值的工业微生物菌种筛选与改良、发酵食品的营养和健康因子解析、营养保健功能评价和作用机制研究、传统发酵食品生产菌种的功能分析与发酵技术等方面的研究工作。承担国家重点研发计划、863计划、国家自然科学基金等国家级科研项目10余项。先后在Food Chemistry, Food & Function, Green Chemistry、Bioresource Technology等国际期刊发表论文150余篇，申请/授权发明专利90余项，多项研究成果在企业得到产业化应用。获得天津市科技进步一等奖1项、天津市科技进步二等奖3项、天津市科技进步三等奖2项，以及天津市产学研合作突出贡献奖等科技奖励。

Carboxymethylation of the polysaccharide from the fermentation broth of Marasmius androsaceus and its antidepressant mechanisms

Yu Qiu a,1 , Yan Su a,1 , Fangming Mou a , Jia Gou a , Xiaoqi Geng a , Xinyue Li a, Zhiqiang Nie b , Jianxin Wang c,d, Yu Zheng a,* , Min Wang a,*

a State Key Laboratory of Food Nutrition and Safety, Tianjin Engineering Research Center of Microbial Metabolism and Fermentation Process Control, College of Biotechnology, Tianjin University of Science & Technology, Tianjin 300457, China

b Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering, Ministry of Education, Institute of Biotechnology, Shanxi University, Taiyuan 030006, China

c Wisconsin Center for NanoBioSystems, School of Pharmacy, University of Wisconsin-Madison, Madison, WI 53706, USA

d Pharmaceutical Sciences Division, School of Pharmacy, University of Wisconsin-Madison, Madison, WI 53706, USA

1 Both authors contributed equally.

*Corresponding authors .

Abstract

To investigate the structure-activity relationship of polysaccharide and obtain a better antidepressant polysaccharide, the antidepressant-like activity of a carboxymethyl polysaccharide (C-MEPS2) subjected to submerged fermentation was systematically studied. PC12-H cell and Kunming mice were used to investigate the differences and their mechanism in the antidepressant effects of C-MEPS2 and MEPS2. Cell experiments have showed that C-MEPS2 has a better antidepressant effect than MEPS2. C-MEPS2 could exert antidepressant effects related to catecholamine synthesis with specific sites of TH, D2DR, and P-CAMKII. In addition, C-MEPS2 could repair the Res-induced damage in PC12-H cell, stabilize the mitochondrial membrane potential and regulate intracellular Ca2+ concentration, thus reducing cell apoptosis caused by RES. Antagonists common dosing experiments on animals further proved that CMEPS2 could significantly improve the antidepressant effect of derivatives without affecting the antidepressant mechanism of MEPS2. It is speculated that it may be related to carboxymethylated modification.

Reference:

QIU Y, SU Y, SONG J, et al. Carboxymethylation of the polysaccharide from the fermentation broth of Marasmius androsaceus and its antidepressant mechanisms[J]. Food Science and Human Wellness, 2023, 12(6): 2417-2427. DOI:10.1016/j.fshw.2023.03.009.

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编辑：梁安琪；责任编辑：张睿梅

封面图片来源：图虫创意