PNAS | 广泛应用的PIN1-GFP融合蛋白导致植物不需要PID：重新思考PIN1和PID之间的关系

光杆针状花序（PIN状花序） 是典型的生长素合成、运输或信号传导发生缺陷的突变表型，其中典型的关键突变体如生长素运输蛋白突变体pin1、AGC激酶突变体pid、生长素信号响应因子突变体arf5（或者称为mp）、生长素合成突变体yuc1 yuc4的增强子npy（同时也是pid突变体的增强子enp）。这些典型的PIN状花序突变体进一步组合会得到更强的发育缺陷表型即胚胎发育缺陷，尤其表现在子叶无法正常发育，继而植株无法成苗，比如pin1 pid双突、pid npy双突、pid pids wag1 wag2（PID及其3个同源基因同时突变）、pid wei8 tar2、pid yuc1 yuc4 （PID及另2个生长素合成关键基因同时突变）。此外，其它基因如MOB1A （Hippo信号通路中的一个关键基因）、VPS28A（胞内运输复合体ESCRT-I的一个关键组分）与PID组成的双突也会导致子叶发育出现缺陷。

PIN与PID单突变均能形成PIN状花序，二者的纯合双突变导致表型进一步增强到子叶发生出现缺陷而无法成苗。已知PID是一个激酶，已有的研究试图证明PID通过直接磷酸化PIN1来指导PIN1的极性定位进而影响生长素的极性运输。另外的研究发现除了PID之外，其它激酶如D6PK、MAPK也能磷酸化PIN1，并发现在pid pid2 wag1 wag2的4突变体中，PIN1仍然能被磷酸化，并且发现PID promoter: D6PK无法回补pid突变、D6PK promoter: PID无法回补d6pk突变，表明PID与PIN1关系并非是简单的PID磷酸化PIN1。

加州大学圣地亚哥分校赵云德教授实验室在对pin1与pid进行遗传互作研究中发现了奇怪的现象，即pin1的杂合突变pin1-27+/-（二倍体的植物体内只有一条染色体上的PIN1是功能正常的）可以抑制pid纯合突变体的PIN状花序表型，产生了可育花序（图1 A、1B）。继而通过CRISPR/Cas9技术创制多种等位突变体发现多种pin1等位突变的杂合形式同样可以抑制多种pid的纯合等位突变（图1 C、1D、1E、1F）。

图1. pin1的杂合突变可以抑制pid纯合突变体的PIN状花序表型。pid-TD1、pid-TD2为pid的等位突变，pin1-27、pin1-c1、pin1-c2、pin1-c3为pin1的等位突变。

为了进一步研究PIN1的功能，作者通过CRISPR/Cas9介导的HDR技术在PIN1的非跨膜loop区融合了一个GFP（前人多用这种GFP融合方式的PIN1-GFP转基因材料进行PIN1相关的定位研究）获得了PIN1-GFPHDR植株，试图在原位来研究PIN1的功能（图2 A）。作者发现PIN1-GFPHDR植株中的GFP信号与先前的PIN1-GFP转基因植株中的GFP信号定位一致（图2 B），然而令人惊讶的是PIN1-GFPHDR植株居然可以抑制多种pid纯合等位突变的PIN状花序表型，均可产生可育花序（图2 C、2D、2E、2F）。最后作者通过蛋白磷酸化分析，证实了PID突变与否，PIN1-GFP融合蛋白或PIN1蛋白本身仍能正常磷酸化，且磷酸化程度无显著差异。该结果也印证了在pid pid2 wag1 wag2的4突变体中，PIN1仍然能被磷酸化的前人研究结论。

图2. PIN1-GFPHDR植株可以抑制多种pid纯合等位突变的PIN状花序表型。pid-TD1、pid-c1、pid-c2为pid的等位突变

综上所述，该研究表明：

1）PIN1与PID存在特殊的遗传互作即 PIN1对PID存在单倍互补效应（haplocomplementation）：减少 PIN1基因剂量可以一定程度消除pid突变导致的花序发育缺陷。

2）根据PIN1对PID的单倍互补效应推测PIN1可能存在某个多亚基复合体中，而并非简单的PID磷酸化PIN1即可说明PIN1的功能。

3）在研究PIN1自身的功能时，使用PIN1-GFP来代替PIN1本身来研究其功能需慎重，以前基于PIN1-GFP的结论可能需要重新评估。

上述研究成果以Suppression of pinoid mutant phenotypes by mutations in PIN-FORMED 1 and PIN1-GFP fusion为题于近日发表在PNAS上。论文的第一作者为赵云德教授实验室的博士生Michael Mudgett，通讯作者为赵云德教授以及Steven P. Briggs教授。

论文链接：

https://doi.org/10.1073/pnas.2312918120