FSHW | 猴头菇多肽KSPLY对H2O2诱导的HepG2细胞氧化损伤的保护作用

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Introduction

猴头菇是一种具有较高营养价值的药食同源食用菌，富含蛋白质、维生素、矿物质、多糖、酚类和萜类等物质，具有抗菌、免疫调节、抗氧化、抗炎、抗肿瘤和降血脂等生物活性。近年来，对猴头菇活性功能成分的研究大多集中在猴头菌多糖、蛋白质和酚类物质上，对其肽的功能活性及相关机制的研究较少。而猴头蛋白由17种氨基酸组成，包括8种必需氨基酸，共鉴定出2543种独特的蛋白质，因此，猴头菇是活性肽的丰富来源。

在先前的研究中，通过超滤和多种色谱技术从猴头菌蛋白质中分离并鉴定出一种生物活性肽Lys-Ser-Pro-Leu-Tyr（KSPLY，Mw 608.38 Da），研究表明其能通过促进巨噬细胞分泌NO、IL-1β、IL-6和TNF-α，表现出良好的免疫调节活性，而肽的免疫调节活性与其抗氧化活性密切相关。通常，活性氧ROS含量在稳态条件下保持平衡，当人体受到有害外部环境的刺激时，ROS的产生和清除之间的平衡被打破，导致活性氧累积，从而损伤细胞、组织和器官，破坏免疫系统。抗氧化肽则具有增强抗氧化防御系统和清除ROS的能力，以增强机体的免疫调节能力。而猴头菇肽KSPLY的抗氧化活性及作用机制尚不清楚，因此，明确其抗氧化活性及作用机制是十分必要的，这为进一步探究其抗氧化作用与免疫调节作用之间的关系以及开发天然抗氧化剂提供了理论基础。

南京财经大学食品与科学工程学院许征莉硕士、杨文建教授等 在本文研究了猴头菇肽KSPLY在H2O2诱导的氧化损伤HepG2细胞中的抗氧化活性及作用机制，测定了细胞凋亡率、细胞周期、ROS水平、MDA含量和细胞内抗氧化酶活性（SOD、GSH-Px、CAT）；测定了Keap1/Nrf2信号通路相关的基因表达探究猴头菇肽KSPLY发挥抗氧化功能的作用机制。

图1 图形摘要

Results and Discussion

细胞活率

细胞活力反映了细胞氧化损伤的程度。如图2B所示，损伤组的细胞活力为（32.61±0.05）%，与对照组相比，损伤组的HepG2细胞存活率显著降低。与损伤组相比，KSPLY预处理（50、100、200、400 μmol/L）相对增加了25.97%～60.82%。细胞的形态如图2C所示。对照组生长状态良好的细胞呈梭形和规则形状，边界清晰，无触角。经H 2 O 2 处理后，HepG2细胞形态发生显著变化，细胞变大变圆，触角不规则，边缘受损。经KSPLY预处理后，部分细胞形态无变化，部分细胞形态变化与损伤组相似。这些结果表明，肽KPSLY对细胞没有毒性副作用，并促进了HepG2细胞的增殖。

图2 KSPLY对HepG2细胞活力的影响

细胞凋亡

细胞凋亡率通常被认为是评价生物活性成分抗氧化活性的一个指标。如图3所示，对照组细胞凋亡率为（13.67±0.05）%，损伤组细胞凋亡率显著增加至（73.29±2.62）%。与损伤组相比，KSPLY预处理组的细胞凋亡率显著降低。AnnexinV-FITC/PI染色结果如图所示，KSPLY预处理组的荧光显著降低，这表明KSPLY预处理显著减少了HepG2细胞的凋亡。这些结果表明，肽KSPLY能有效保护HepG2细胞免受氧化损伤。

图3 KSPLY对HepG2细胞凋亡的影响

细胞周期

结果如图所示，与对照组相比，损伤组的G0/G1细胞数量从63.01%增加到74.93%，S期细胞数量从18.9%显著减少到10.39%，这表明损伤组的HepG2细胞被阻滞在G0/G1期。然而，KSPLY预处理组和对照组之间的细胞周期没有差异。结果表明，H 2 O 2 诱导DNA损伤，将HepG2细胞阻滞在G0/G1期，并限制其进入S期复制DNA，从而抑制细胞增殖。KSPLY预处理组，HepG2细胞阻滞在G0/G1期的现象没有出现。这表明KSPLY能够保护HepG2细胞的DNA免受氧化损伤并促进细胞的增殖。

图4 KSPLY对HepG2细胞周期的影响

ROS水平

KSPLY的活性氧清除能力如图5所示。与对照组相比，损伤组的ROS水平相对增加至1.8±0.05，表明H 2 O 2 处理的HepG2细胞正在经历氧化应激。然而，与损伤组相比，经KSPLY预处理的HepG2细胞的ROS水平分别下降（19.76±0.14）%、（35.19±0.03）%、（31.23±0.08）%、（33.57±0.01）%、（18.62±0.17）%。此外，损伤组的荧光强度比对照组强，但与损伤组相比，KSPLY预处理组的荧光强度较弱（图5C）。这些结果进一步证实了KSPLY在体外具有良好的ROS清除能力。

图5 KSPLY对HepG2细胞ROS水平的影响

酶活性

细胞内抗氧化酶系统对氧化应激损伤起着重要的防御作用。其中，SOD负责清除细胞中的超氧阴离子。CAT通过将H 2 O 2 分解为水和氧有利于细胞存活。此外，谷胱甘肽过氧化物酶是一种过氧化物分解酶，可以催化过氧化氢等过氧化物被谷胱甘肽还原为无毒的羟基化合物。猴头菇肽KSPLY能显著增强抗氧化酶活性。此外，其还能有效降低MDA水平，减轻细胞的氧化损伤。

图6 KSPLY对HepG2细胞抗氧化酶活性的影响

KSPLY发挥抗氧化作用的机制探究

猴头菇肽KSPLY对Keap1/Nrf2通路的影响如图7所示。与对照组相比，损伤组显著上调Keap1的基因表达，下调Nrf2、Ho-1和Nqo1的基因表达。与损伤组相比，KSPLY预处理组（25、200、400μmol/L）中Keap1的表达下调，Nrf2、Ho-1和Nqo1的表达上调。

图7 KSPLY对Keap1/Nrf2信号通路基因表达的影响

Conclusion

本研究结果表明，猴头菌肽KSPLY对H 2 O 2 诱导的氧化损伤HepG2细胞具有保护作用。其可降低细胞凋亡和MDA含量，清除ROS，减少HepG2细胞的细胞阻滞。此外，KSPLY预处理通过Keap1/Nrf2信号通路促进抗氧化酶的表达，从而有效保护HepG2细胞免受氧化损伤。

第一作者

许征莉，女，汉族，2019级学术型硕士研究生。主要研究方向为食品营养化学，以第一作者发表研究论文1 篇。

通信作者

杨文建，男，工学博士，南京财经大学食品科学与工程学院教授，主要研究方向为食品营养化学、天然活性物质与功能评价、果蔬贮藏保鲜与精深加工等。目前主持科研项目20 项，其中省部级以上项目15 项。相关研究成果发表SCI论文60余篇，申请发明专利25 项，其中已授权14 项，制定标准10 项，研究成果获得江苏省科学技术奖一等奖，教育部高等学校科学研究优秀成果科技进步二等奖，中国商业联合会服务业科技创新奖一等奖。2015年入选江苏省“六大人才高峰”高层次人才；2018年入选江苏省“优秀青年基金”项目获得者；2020年入选江苏省“青蓝工程”中青年学术带头人；2021年入选江苏省“333”高层次人才培养工程（第二层次）；2021年入选国家高层次人才特殊支持计划。

Protective effects of peptide KSPLY derived from Hericium erinaceus on H2O2-induced oxidative damage in HepG2 cells

Zhengli Xu, Qiuhui Hu, Minhao Xie, Jianhui Liu, Anxiang Su, Hui Xu, Wenjian Yang*

College of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics/Collaborative Innovation Center for Modern Grain Circulation and Safety, Nanjing 21023 China

*Corresponding author.

Abstract

Reactive oxygen species (ROS)-induced oxidative damage is strongly associated with the pathogenesis of chronic diseases, and natural antioxidant peptides have good abilities of scavenging ROS. The antioxidant activity of peptide Lys-Ser-Pro-Leu-Tyr (KSPLY) derived from Hericium erinaceus remains unclear. In the present study, the antioxidant effect and mechanism of KSPLY on H2O2-induced oxidative damage in HepG2 cells were investigated. The results indicated that KSPLY exhibited the antioxidant capacity in H2O2-induced HepG2 cells by enhancing superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GSH-Px), and catalase (CAT) activities. In comparison with the H2O2-treated damage group, the apoptosis rate, ROS level, and malondialdehyde (MDA) content of HepG2 cells treated with KSPLY were significantly decreased. The H. Erinaceus-derived peptide KSPLY pretreatment promoted the expression of detoxification and antioxidant enzymes via the Keap1/Nrf2 signal pathway, thereby inhibiting the generation of ROS and MDA. In conclusion, the H. erinaceus-derived peptide KSPLY effectively protected HepG2 cells against H2O2-induced oxidative damage, and it provided a theoretical basis for the further development of new natural antioxidants.

Reference:

XU Z L, HU Q H, XIE M H, et al. Protective effects of peptide KSPLY derived from Hericium erinaceus on H2O2-induced oxidative damage in HepG2 cells[J]. Food Science and Human Wellness, 2023, 12(5): 1893-1904. DOI:10.1016/j.fshw.2023.02.041.

文章编译内容由作者提供

编辑：梁安琪；责任编辑：张睿梅

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