小分子药物设计的进步：新方法和新见解

2023年8月1日，来自加州大学洛杉矶分校琼森综合癌症中心的Yong Wu等人在Drug Discov Today发表文章Advancements in small molecule drug design: A structural perspective。

文章从结构角度概述了近年来小分子药物设计中出现的新方法和新见解，主要阐述了准确预测蛋白质结构对于小分子药物设计的重要性（比较了同源建模和从头建模）、药物设计中小分子的关键结构特征（如官能团、立体化学和分子量）和特性、预测和优化小分子结构的计算工具和方法、基于分子结构的小分子药物设计的成功案例。最后讨论了小分子药物设计的新趋势和未来方向，如新计算工具的出现、新兴靶点的确认以及新型治疗应用的探索。

文章强调将结构信息与其他工具和数据源相结合，以实现更高效、更有效的小分子药物发现和开发。

小分子药物发现中的蛋白质三维结构预测

准确预测蛋白质的三维结构已成为药物设计领域的一个关键环节，近年来备受关注。了解蛋白质的三维结构对于阐明药物结合机制、以及促进设计具有更强特异性和效力的化合物至关重要。计算技术的显著进步促进了对蛋白质结构的高精度预测。

同源建模

同源建模又称比较建模，它利用已知的相关蛋白质结构来预测目标蛋白质的结构。这种方法假定进化相关的蛋白质具有相似的结构，而且蛋白质的结构比其序列更为保守。同源建模的过程包括模板选择、序列比对、模型构建和模型完善等几个步骤。

同源建模步骤

1.模板选择：从蛋白质结构数据库中选择合适的模板结构。模板结构应与目标蛋白质序列高度同源，并具有相似的功能或折叠。FASTA 和 BLAST 等几种方法可用于识别蛋白质结构数据库中的同源序列。

2.序列比对：将目标蛋白质序列与选定的模板结构进行比对。应优化配对以确保目标结构和模板结构之间的保守区正确配对。有几种算法，如 ClustalW 和 MUSCLE，可用于进行序列比对。

3.建立模型：根据对齐的目标和模板序列生成目标蛋白质的三维模型。模型的建立是将目标序列叠加到模板结构上，并调整侧链以适应目标序列。一些软件程序（如 MODELLER 和 SWISS-MODEL）可用于建立模型。

4.模型完善：初始模型生成后，需要对其进行完善以提高准确性。这一步骤包括优化侧链方向、最小化结构能量，以及进行结构验证以确保模型在生物学上的合理性。CHARMM 和 GROMACS 等多个软件程序可用于模型完善。

图 1. 小分子药物发现中预测蛋白质三维结构的计算方法示意图。同源建模利用相关蛋白质的已知结构来预测目标蛋白质的结构。这一过程包括模板选择、序列比对、模型建立和模型完善。而从头蛋白质结构预测的过程包括片段组装、模型建立和模型完善。

从头建模

另一种方法是从头蛋白质结构预测，即不依赖已知结构，从头开始预测蛋白质的结构。从头开始蛋白质结构预测是根据蛋白质的氨基酸一级序列预测蛋白质三级结构的算法过程，而无需使用先前已解决结构的模板。这一过程涉及多个步骤，包括片段组装、模型建立和模型完善。这一过程可由基于知识的能量函数或机器学习算法指导。

从头蛋白质结构预测步骤

片段组装。这包括将蛋白质序列分解成较小的片段，并预测这些片段在三维空间中的相对方向。片段组装可采用物理方法或统计方法。基于物理的方法通过计算系统能量来确定片段的最佳取向，而统计方法则是根据已知结构来确定特定片段组装的可能性。

模型构建。模型构建过程可由基于知识的能量函数或从以往成功预测中学习的 ML 算法指导，后者可为模型质量提供评分。这可以通过分子动力学模拟、能量最小化算法或 ML 方法来实现。

二者的比较

这两种方法对于了解药物结合机制和设计特异性更强、药效更高的药物都至关重要。

同源建模通常比从头建模更准确，因为它依赖于相关蛋白质结构的可用性。同源建模被认为是蛋白质结构预测最准确的方法，常用于药物设计中的大型库筛选。同源模型包含蛋白质中重要残基空间排列的充分信息，如果模板序列和查询序列具有较高的序列相似性，则可获得准确的预测结果。

然而，同源建模也有局限性，尤其是对于只有远缘同源物或没有已知结构同源物的蛋白质。对于这些蛋白质，精确的模板-查询比对和模板选择仍然非常具有挑战性，很难获得准确的模型。在这种情况下，从头建模可能很有用，因为它不依赖于相关蛋白质结构的可用性。从头建模也可用于可用模板不能很好匹配查询序列、或可用模板与查询序列同一性较低的情况。不过，基于深度学习的预测技术的最新进展表明，通过将基于深度学习的预测扩展到除距离以外的残基间取向，以及 Rosetta 开发的约束优化技术，可以生成更准确的模型。

总之，准确的蛋白质结构预测对于设计能与靶蛋白特异性结合、而又不产生脱靶效应的小分子候选药物至关重要。准确预测蛋白质结构的能力也促进了针对以前被认为"不可药用"的蛋白质的新药开发。

配体结合口袋在基于结构的小分子药物设计中的关键作用

配体结合口袋在基于结构的小分子药物设计中起着至关重要的作用。这种设计方法的出发点是假设药物分子通过与大分子靶受体（通常是蛋白质）的特异性结合来发挥其生物活性。结合口袋指的是目标蛋白质表面的空腔或凹陷，配体在此与蛋白质结合并相互作用。通过与结合口袋的精确配合，配体可以调节蛋白质的功能，从而产生潜在的治疗效果。

基于结构的药物设计的主要目标之一是找出能与目标蛋白质的结合口袋产生高亲和力和特异性结合的配体。这一过程涉及多个步骤，包括目标选择、分子对接和虚拟筛选。

分子对接模拟使用计算方法来预测小分子在目标蛋白质结合袋中的结合模式和结合亲和力。这些模拟有助于确定潜在的候选药物，并优化它们与结合袋的相互作用。X 射线晶体学和低温电子显微镜等结构生物学技术的进步促进了蛋白质-配体复合物结构的确定，为了解结合相互作用提供了宝贵的信息。

此外，结合口袋的可药性也是小分子药物设计的一个重要考虑因素。可药用性是指成功开发出能与目标蛋白质结合并调节其功能的药物的可能性。包括 MD 模拟和虚拟筛选在内的计算方法有助于评估结合口袋的可药性，并指导设计具有最佳结合特性的小分子药物。

在基于结构的药物设计中，配体结合口袋的重要性主要体现在以下几个方面。

基于结构的药物设计中配体结合口袋的重要性

(i) 特异性和亲和性：配体结合口袋提供了一个容纳配体的三维环境，具有高度的特异性和亲和力。口袋的形状、静电特性和化学成分决定了配体与蛋白质的相互作用和结合强度。

(ii) 合理的配体设计：了解配体结合口袋的结构可以进行合理的配体设计。通过研究口袋的特征，如大小、形状和口袋内的残基，研究人员可以设计出最适合口袋并能与周围蛋白质残基产生良好相互作用的小分子。

(iii) 基于结构的优化：配体结合口袋是结构优化的目标。通过分析配体与口袋之间的相互作用，药物化学家可以修改配体的化学结构，以提高其结合亲和力、选择性和药理特性。这一优化过程可能涉及引入官能团、调整分子特性或探索骨架的修改。

(iv) 药物选择性和脱靶效应：了解配体结合口袋的特征对于实现药物选择性至关重要。通过设计能精确进入靶蛋白结合袋的配体，可以提高药物的特异性，减少脱靶效应。这种特异性对于减少潜在副作用和提高治疗效果也至关重要。

了解配体结合袋的结构和化学特征，并采用计算技术和结构生物学方法，可以识别和优化具有选择性和高亲和力的配体，最终促进有效治疗干预措施的开发。

小分子药物设计中需要考虑的关键结构特征

基于结构的药物设计（SBDD）是药物发现的一种重要方法，它利用计算工具预测小分子在蛋白质三维结构表征中的位置，并以相当高的准确度和效率估算配体与目标蛋白质的亲和力。

药物的分子结构是其与生物靶点相互作用并产生治疗效果的关键因素。具有特定结构特征的小分子可设计成与靶蛋白结合，具有高度特异性。而生物制剂通常是复杂的大分子，可设计成与体内特定受体或通路相互作用。

功能基团是小分子药物设计中常用的关键结构特征之一（图 2）。特别是，羟基（-OH）、羧基（-COOH）和氨基（-NH2）等某些官能团的存在可使小分子与特定的酶或受体相互作用，并赋予其在体内的特定药理特性。

小分子药物设计的另一个关键方面是立体化学（图 2），它指的是分子中原子的三维排列，以及它如何影响分子与生物靶点的相互作用。

图 2. 小分子药物设计中考虑的关键结构特征。这些特征包括赋予药物特定药理特性的官能团（如羟基、羧基和氨基），可影响药物与生物靶点相互作用的立体化学，影响药代动力学和药效学的分子量、大小和形状，以及影响药物物理和化学特性的特定化学键和静电特性。了解这些特征对于设计具有所需药理特性的有效小分子药物至关重要。

分子量也是小分子药物设计中的一个重要考虑因素，因为分子量会影响药物的药代动力学和药效学。例如，分子量低的药物可被迅速吸收并排出体外，而分子量高的药物半衰期可能较长，需要的剂量也较低。

其他结构特征包括分子的形状、特定化学键的存在以及分子的静电特性（图 2）。分子中特定化学键的存在会影响其结构和性质。

小分子药物设计的计算方法

近年来，计算方法在药物设计中的应用迅速增加，有许多工具可用于支持这一过程。小分子药物设计中最常用的一些计算方法如下（图 3）。

图 3. 小分子药物设计中使用的主要计算方法。

分子对接涉及预测小分子与大分子靶点的结合亲和力和方向。

虚拟筛选是一种既经济又省时的方法，可帮助研究人员缩小需要进一步实验分析的化合物数量。

分子动力学模拟可以详细了解系统中原子和分子的物理运动和相互作用。

量子力学/分子力学计算结合了量子力学计算的准确性和分子力学模拟的速度，用于研究化学和生化系统。

机器学习算法使用计算方法来预测潜在小分子候选药物的特性。这些计算方法广泛应用于药物发现和先导优化，以确定潜在的药物靶点，并预测分子配体与靶点在原子水平上的相互作用。

分子对接

分子对接是小分子药物设计中使用的主要计算方法之一。分子对接涉及预测小分子与蛋白质或酶等大分子靶点的结合亲和力和定向。对接算法使用能量最小化和评分函数来评估配体-蛋白质复合物的稳定性，并对潜在候选药物进行排序。分子对接过程有助于研究人员深入了解药物-蛋白质相互作用、蛋白质-蛋白质相互作用和酶促反应等各种生物过程的分子机制。对接过程会产生配体与目标蛋白质结合位点的多种可能构象和取向。

过去几年，分子对接领域取得了长足进步，大大提高了这一技术的精确性和有效性。例如，(i) 人们开发了化学自由能方法（如自由能扰动和热力学积分）来计算配体与蛋白质的结合自由能。(ii) 新的对接工具，如 HADDOCK 和 RosettaDock，已被开发出来将蛋白质的柔性纳入对接模拟。(iii) ML 已被纳入对接工具，以提高其预测准确性。通过在具有实验测得结合亲和力的已知配体-蛋白质复合物上进行训练，ML 模型可以学习模式并对新的、未见过的复合物进行预测。

虚拟筛选

近年来流行的另一种方法是虚拟筛选，即利用分子对接或其他技术筛选大型化合物库中的潜在候选药物。这是一种成本效益高、节省时间的方法，可帮助研究人员缩小需要进一步实验分析的化合物数量。虚拟筛选用于确定可能与目标蛋白质结合的小分子。它涉及使用各种软件工具，如 GOLD、基于网格的配体与能量对接（GLIDE）和 Autodock Vina。在药物发现方面，虚拟筛选可用于识别具有特殊性质的化学结构。这一过程可帮助研究人员识别潜在的候选药物，这些药物可选择性地与目标蛋白质相互作用，同时将副作用降至最低。

虚拟筛选过程包括三个主要步骤：制备目标蛋白质结构、制备化合物库以及针对目标蛋白质筛选化合物。

虚拟筛选的三个主要步骤

在目标蛋白质结构的制备过程中，通过去除任何水分子或共晶体配体来优化蛋白质。

在化合物库的制备过程中，需要创建一个庞大的小分子化合物数据库，从中找出潜在的先导化合物。

在针对目标蛋白质筛选化合物时，根据化合物与目标蛋白质的预测结合亲和力对化合物进行排序。

虚拟筛选结果的准确性取决于蛋白质结构和化合物库的质量。此外，虚拟筛选过程不考虑化合物的药代动力学和毒理学特性。因此，通过虚拟筛选确定的化合物需要经过实验验证，以确定其疗效和安全性。它包括使用软件工具从大型分子数据库中识别潜在的先导化合物。

MD 模拟

分子动力学模拟将牛顿运动方程随时间推移进行整合，以获得系统中原子/分子的运动情况，从而提供有关系统在原子水平上宏观行为的定量和定性信息。

MD 模拟包括对经典运动方程的逐步数值求解，对于一个简单的原子系统，该方程可以写成 m_i * a_i = f_i，其中 m_i 是粒子 i 的质量，a_i 是粒子 i 的加速度，f_i 是作用在粒子 i 上的力。原子间势能函数可通过量子力学、经验势能或两者的结合获得。

图 4 分子动力学 (MD) 模拟的基本步骤和工作原理

(a) 药物研究中的分子动力学模拟步骤示意图。该图说明了为药物研究进行 MD 模拟的顺序步骤。设置和准备阶段包括获取蛋白质和药物分子的三维结构并将其转换为适当的文件格式。定义温度、压力和时间步长等基本模拟参数。此外，还要根据系统和研究目标选择合适的力场。选择与所选力场兼容的模拟软件非常重要。

(b) 在模拟过程中，要进行能量最小化处理，以减轻立体冲撞并将系统中的势能降至最低。平衡阶段通过限制特定原子并允许溶剂分子在蛋白质-药物复合物周围进行调整，使系统逐渐松弛。随后，进行随时间变化的分子动力学运行，对运动方程进行数值积分以生成原子轨迹。

(c) 拓扑文件分析包括各种指标。均方根偏差（RMSD）用于测量不同时间点的不同结构与参考结构之间的平均偏差。均方根波动（RMSF）可确定蛋白质和药物的原子波动，从而深入了解其灵活性和稳定性。回旋半径（Rg）可量化蛋白质-药物复合物的紧密度或空间范围。通过评估氢键来了解它们的形成和动态，从而发现潜在的相互作用。最后，计算溶剂可及表面积（SASA），分析蛋白质和药物与周围溶剂分子的相互作用。

MD 模拟可用于研究多种系统，包括生物大分子、材料科学和化学物理。当应用于生物大分子时，MD 模拟可以深入了解蛋白质和核酸的动态行为，包括分子中原子相对位置的波动。MD 模拟可采用不同的详细程度，从模拟单个原子的原子模拟到将多个原子组合成伪粒子的粗粒度方法。

MD 模拟是一种功能强大的计算工具，可以详细揭示系统中原子和分子的物理运动和相互作用。模拟将牛顿运动方程随时间推移进行整合，从而获得系统中原子/分子的运动情况，并能在原子水平上提供有关系统宏观行为的定量和定性信息。

最近，在 MD 模拟领域出现了以下值得注意的进展：(i) 深度学习算法越来越多地应用于 MD 模拟。例如，原子卷积网络（Atomic Convolutional Networks）已被用于直接从原子坐标预测分子的势能，从而显著提高 MD 模拟的准确性。(ii) 元动力学（metadynamics）等增强型采样技术已被开发出来，以克服传统 MD 模拟的局限性。(iii) 为了降低 MD 模拟的计算成本，人们开发了粗粒度模型，通过将原子分组来简化系统的表征。(iv) GPU 加速工具（如 GROMACS 和 AMBER）的开发可加快 MD 模拟的速度。这些进步大大提高了 MD 模拟的精度和效率。

然而，挑战依然存在，例如蛋白质柔性的准确预测和大规模模拟的计算成本。这一领域正在迅速发展，可以期待未来几年的进一步改进。

量子力学/分子力学计算

量子力学/分子力学（QM/MM）计算是一种强大的计算方法，用于在原子和分子水平上研究化学和生化系统。QM/MM 方法结合了量子力学计算的准确性和分子力学模拟的速度。这种方法可以计算热力学性质和反应动力学特征，是研究溶液或酶中化学和生化系统的重要工具。

在传统的分子力学和量子力学计算中，分子间和分子内的相互作用是针对给定的系统冻结构型进行评估的，通常没有明确的溶解作用。然而，QM/MM方法可将 QM 区域视为溶质，MM 区域视为溶剂，从而将溶解效应考虑在内。QM/MM 方法的优势之一是能够模拟更大的系统，而不是仅用量子力学ab initio 方法就能处理的系统。由于化学和生物化学中许多相关系统的大小，仅用量子力学方法无法高效准确地处理这些系统。总体而言，QM/MM 方法是研究原子和亚原子尺度的物质和光行为的重要工具，是了解分子和原子及其组成物特性的有用方法。

ML 算法

ML 算法在预测小分子性质方面越来越受欢迎。这些算法使用计算方法预测潜在小分子候选药物的特性，如溶解性、毒性和结合亲和力。药物发现领域主要讨论了两类 ML 方法：传统 ML 方法（如基于树的方法、潜在变量方法）和深度学习方法。

计算方法在推动小分子药物设计领域的发展方面取得了长足的进步；然而，这些方法并非没有其固有的局限性。在这种情况下，有几个关键挑战值得仔细考虑，包括考虑蛋白质的灵活性、改进评分函数、解决溶剂效应、延长模拟时间尺度、管理计算成本、获取足够的实验数据、预测诱导拟合以及准确预测脱靶效应。

计算方法在小分子药物设计中应用的关键挑战

(i) 蛋白质的灵活性：传统的对接算法通常将蛋白质视为一个刚性体，这是一种严重的过度简化。蛋白质是高度动态的，可以采用多种构象。考虑这种灵活性是对接算法的一大挑战。

(ii) 评分函数：对接算法中用于预测配体与蛋白质结合亲和力的评分函数往往不准确。它们通常基于分子相互作用的简化模型，不能完全反映这些相互作用的复杂性。

(iii) 溶剂效应：许多对接算法没有充分考虑溶剂的影响。溶剂在相互作用中起着至关重要的作用，忽略这些效应可能导致预测结果不准确。

(iv) 时间尺度：MD 模拟可以模拟分子的动态行为，但受到模拟时间尺度的限制。大多数模拟的时间尺度为纳秒到微秒，而许多生物过程的时间尺度为毫秒到秒。

(v) 计算成本：对接和 MD 模拟都是计算密集型的。这限制了可研究系统的大小和可进行模拟的时间长度。

(vi) 缺乏实验数据：通常缺乏实验数据来验证对接和 MD 模拟的预测结果。因此很难评估这些方法的准确性。

(vii) 难以预测诱导拟合：许多对接算法难以预测配体与蛋白质结合时发生的构象变化，这种现象被称为诱导配合。

(viii) 预测脱靶效应的局限性：虽然计算方法在预测药物与其预期靶点之间的相互作用方面正在不断改进，但预测潜在的脱靶效应仍是一项重大挑战。尽管存在这些挑战，用于小分子药物设计的计算方法仍在不断发展。这些工具可以帮助研究人员提出新的假设，分析大型数据集，并设计出具有更强疗效和安全性的候选新药。

未来，新兴的计算工具和技术可能会进一步推动小分子药物设计领域的发展。

案例研究

近年来，有几项引人注目的案例研究强调了分子结构在小分子药物设计中的重要性。这些案例研究展示了基于结构的药物设计的成功应用，并为药物的发现过程、作用机制和药理特性提供了深入的见解。

其中一个例子是用于治疗慢性淋巴细胞白血病 (CLL) 和小淋巴细胞淋巴瘤 (SLL) 的小分子药物 Venetoclax。Venetoclax 可选择性地与 BCL-2 结合，通过阻断 BCL-2 与促凋亡蛋白之间的相互作用导致癌细胞凋亡。Venetoclax 已被证明可有效治疗 CLL 和 SLL，并具有良好的安全性。Venetoclax 的发现得益于基于结构的药物设计方法的应用，该方法涉及使用计算和实验技术来设计可选择性地与靶蛋白结合的小分子、通过 X 射线晶体学确定了 BCL-2 的结构，从而确定了 Venetoclax 的结合位点并进行了合理设计。

用于治疗囊性纤维化的药物 ivacaftor是采用基于结构的药物设计方法开发的。该过程包括选择药物靶点、确定蛋白质结构、识别潜在的结合位点、使用 CADD 工具设计小分子药物，以及测试药物的有效性和安全性。

结束语和未来方向

随着结构生物学和计算方法的不断进步，我们对分子结构和药物疗效之间关系的理解也在不断扩大，研究人员正在寻找新的创新方法来设计比以往更有效、更具选择性和安全性的小分子药物。

这一领域的关键研究之一是开发用于预测和优化小分子结构特性的新计算工具和方法。随着药物靶点的规模和复杂性不断增加，使用传统方法设计药物变得更加困难，因此这些工具变得越来越重要。小分子药物设计中正在使用的一些新兴计算方法包括 ML 算法、MD 模拟和量子力学计算。此外，还开发了统计模型等其他计算工具和方法，用于预测小分子药物的毒性和副作用。

小分子药物设计的另一个重要趋势是探索新的治疗应用。传统的药物设计主要集中于治疗癌症和心血管疾病等常见疾病，而现在研究人员开始研究小分子药物在治疗罕见和被忽视疾病方面的潜力。

最后，结构生物学领域的新技术和创新可能会塑造小分子药物设计的未来。例如，低温电子显微镜的最新发展彻底改变了研究人员研究生物大分子结构的方式，并已推动新药靶点的发现和新药的开发。

参考资料

Wu K, Karapetyan E, Schloss J, Vadgama J, Wu Y. Advancements in small molecule drug design: A structural perspective. Drug Discov Today. 2023 Aug 1:103730.

doi: 10.1016/j.drudis.2023.103730.

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