《食品科学》：天津科技大学钟成教授：非酿酒酵母产乙酸乙酯的诱变菌株筛选及其安全性评价

乙酸乙酯是一种重要的酯类物质，在发酵食品白酒、黄酒、葡萄酒、啤酒、酱油、醋等产品中均存在乙酸乙酯为主的酯类风味物质。因此，在发酵过程中添加产酯酵母，提高乙酸乙酯的含量，可以使发酵食品的风味品质得到强化。实验室保存了1 株具有产乙酸乙酯的优势的非酿酒酵母Nakazawaea ishiwadae GDMCC 60786，但目前有关N. ishiwadae的相关研究较少。

天津科技大学生物工程学院马文瑞、钟 成*，中国食品发酵工业研究院、国家酒类品质与安全国际研究中心孙志伟、薛 洁*等，通过物理诱变常压室温等离子体和化学诱变甲基磺酸乙酯、亚硝基胍筛选突变菌株，以YPD作为基础培养基，添加乙醇和乙酸作为底物，观察突变菌株的产酯能力和耐受性。最终，筛选出1 株遗传稳定好且高产乙酸乙酯的突变菌株并对其安全性进行了评价，进一步拓宽了该菌株在发酵领域的应用。

1、最佳诱变条件的确定

由图2A可知，细胞致死率随着诱变时间延长而增大，诱变时间为60 s时，致死率达到81.0%，诱变时间为100 s时，致死率达到99.4%，因此确定该菌株的ARTP最佳诱变时间为60 s。

由图2B可知，随着NTG质量浓度的不断增加，细胞致死率不断增加，NTG质量浓度为0.4 mg/mL，致死率达到86.6%，NTG质量浓度为0.8 mg/mL时，致死率接近100%。为了提高突变率，确定该菌株的NTG最佳诱变质量浓度为0.4 mg/mL。

由图2C可知，随着EMS体积分数不断增加，细胞致死率不断增加，EMS体积分数为1%时，致死率仅有45.7%，EMS体积分数为2%时，致死率增加到约2 倍，达到82.2%，EMS体积分数为4%时，致死率达到95.9%，确定EMS最佳诱变体积分数为2%。

2、突变菌株初筛

对出发菌株进行诱变，点对点接种在筛选培养基中，共选取有明显透明圈的154 个单菌落，再次进行牛津杯透明圈筛选，如图3所示。

最终，ARTP诱变后，选取直径较大的A5、A6、A8、A9、A10、A11、A12、A14、A16、A30、A31、A34、A35共13 个突变菌株进行复筛。通过NTG诱变后，确定N2、N5、N8、N12、N13、N18、N21、N23、N38共9 株突变菌株进行复筛。通过EMS诱变后，确定E9、E10、E11、E12、E13、E14、E15、E33、E34、E35、E36、E37、E38共13 个突变菌株进行复筛。因此，初筛共获得35 个突变菌株。

3、突变菌株复筛

将初筛获得的35 个突变菌株，进行摇瓶发酵，检测乙酸乙酯质量浓度。结果发现，发酵1 d时，所有突变菌株的乙酸乙酯质量浓度达到最大值，如图4所示。

与出发菌株相比，正、负突变菌株均存在。ARTP诱变中，仅有A12为正突变菌株，乙酸乙酯质量浓度增加了0.13 倍。NTG诱变中，N5和N8为正突变菌株，与出发菌株相比，分别增加了1.96 倍和0.38 倍。EMS诱变中，13 个突变菌株均为正突变菌株，其中E15乙酸乙酯质量浓度最高，增加了1.06 倍；E34乙酸乙酯质量浓度最低，增加了0.02 倍。由此看出，以提高乙酸乙酯为目的，对出发菌株进行诱变，化学诱变比物理诱变效果更加明显，EMS正突变菌株占比最高，但是诱变效率不高。然而，NTG突变菌株中发现了乙酸乙酯质量浓度增加最高的突变菌株N5，为786.64 mg/L。ARTP诱变效率最低。

对上述16 个正突变菌株摇瓶发酵，在YPD培养基基础上分别添加底物乙醇和乙酸，检测其产乙酸乙酯能力和耐受性，如图5所示。

由于乙醇作为补充碳源，所有菌株的乙酸乙酯质量浓度均提高，其中乙酸乙酯产量最高的菌株是N5和E15，分别是1 426.81、1 469.91 mg/L，与出发菌株相比，分别增加了0.12、0.15 倍，但差异不明显。剩余突变菌株平均产乙酸乙酯质量浓度为1 264.53 mg/L，与出发菌株接近。乙酸作为碳源，几乎使所有菌株失去产酯能力。由此看出，外加乙醇后，一方面，所有菌株产酯能力明显提升，说明该菌株不仅有耐受乙醇的能力，而且乙醇作为底物提高产酯效率；另一方面，与出发菌株相比，增加趋势不明显。外加乙酸，几乎使所有菌株失去产酯能力，说明此种菌株对酸性环境耐受性较差，并且乙酸对于产酯的远贡献小于乙醇。综上所述，通过初筛和复筛检测分析，选用突变菌株N5进行后续研究，将其命名为N. ishiwadae N5。

4、遗传稳定性分析

如图6A所示，出发菌株的乙酸乙酯、pH值和生物量的平均值分别是263.86 mg/L、4.89、7.01 g/L。如图6B所示，突变菌株N5的乙酸乙酯、pH值和生物量的平均值分别是764.52 mg/L、5.29、7.13 g/L。

由此看出，突变菌株N5葡萄糖转化率达到38.22%，与出发菌株相比，乙酸乙酯提高了1.90 倍，葡萄糖转化率提高了25.03%。同时，出发菌株和突变菌株N5均具有良好遗传稳定性。

5、酯酶、乙酰辅酶A和醇酰基转移酶活性分析

由图7A可知，24 h时，突变菌株N5酯酶活性达到最大值，为655.88 IU/L，与出发菌株相比，增加了0.34 倍。但是，12 h时，出发菌株酯酶活性高于突变菌株0.86 倍，可能是出发菌株的细胞生长快于突变菌株，酶活性积累也较快。

由图7B可知，从整体看，两株菌的乙酰辅酶A活性均呈先增后降趋势。12 h时，出发菌株乙酰辅酶A活性仍高于突变菌株N5 0.17 倍。24 h时，突变菌株N5乙酰辅酶A活性达到最大值，为84.77 IU/L，与出发菌株相比，增加了0.28 倍。但是，36 h时，出发菌株乙酰辅酶A活性达到最大值，为66.10 IU/L，比突变菌株增加了0.14 倍。由此说明，在对数增长期间，出发菌株比突变菌株生长速率快，酶活积累也较快，但是到达稳定期，突变菌株酶活性增强，可能是酶蛋白表达量较高，导致乙酸乙酯含量增加。

由图7C可知，从整体看，出发菌株的醇酰基转移酶活性随时间延长而逐渐降低，诱变菌株则呈先增后降趋势。24 h时，突变菌株N5醇酰基转移酶活性达到最大值，为123.90 IU/L，比出发菌株增加了0.55 倍。

综上，24 h时，突变菌株N5的酯酶、乙酰辅酶A和醇酰基转移酶活性均达到最大值，与此阶段乙酸乙酯质量浓度呈现最大值的结果一致。此外，突变菌株N5产酯高可能与酯酶、醇酰基转移酶活性有关。

6、体外安全性评价

6.1溶血结果分析

如图8所示，出发菌株和突变菌株N5没有出现溶血现象，为γ溶血，说明N. ishiwadae这类菌株在溶血方面没有致病性，相对安全。

6.2耐药性分析

本实验选取4种常见的真菌抗生素，进行菌株耐药性评价，如表2所示，出发菌株和突变菌株N5对4 种抗生素产生一定程度的敏感；其中，出发菌株和突变菌株N5均对氟胞嘧啶敏感，对氟康唑和卡泊芬净中度敏感，而出发菌株和突变菌株N5对两性霉素B分别为中度敏感和敏感。该菌株对4 种抗真菌药物产生敏感现象，但是否携带耐药基因需要进一步验证。

结论

以非酿酒酵母N. ishiwadae作为研究对象，对其进行ARTP、EMS和NTG诱变，确定了最佳诱变条件。以三丁酸甘油酯平板透明圈初筛和YPD摇瓶发酵复筛，得到1 株NTG诱变菌N5具有高产乙酸乙酯的能力且遗传稳定性好，将该诱变菌连续传代5 次，得到乙酸乙酯平均值为764.52 mg/L，葡萄糖转化率达到38.22%，与出发菌株相比，乙酸乙酯提高了1.90 倍，葡萄糖转化率提高了25.03%。外加底物乙醇后，出发菌株和突变菌株N5乙酸乙酯质量浓度明显提高，分别为1 276.74、1 426.81 mg/L。但是，外加底物乙酸后，出发菌株和突变菌株基本不生长，并失去产酯能力。该菌株对乙醇耐受性强于乙酸，并有良好的遗传稳定性。对出发菌株和突变菌株的菌胞内酯酶、乙酰辅酶A和醇酰基转移酶活性进行测定，24 h时，突变菌株的3 类酶活性均达到最大值，其中，酯酶活性达到最大值为655.88 IU/L，与出发菌株相比，增加了0.34 倍；乙酰辅酶A活性达到最大值为84.77 IU/L，与出发菌株相比，增加了0.28 倍；醇酰基转移酶活性达到最大值123.90 IU/L，比出发菌株增加了0.55 倍。对出发菌株和突变菌株N5进行溶血性和耐药性分析，发现该菌株不发生溶血现象，对4 种真菌抗生素出现不同程度的敏感现象，说明该菌株具有良好的体外安全性。对于该菌株高产乙酸乙酯的发酵性能和合成代谢途径需要进一步研究。

作者简介

第一作者简介：

马文瑞（1991—）（ORCID: 0000-0001-9434-4354），女，博士研究生，研究方向为发酵工程。E-mail: mawenrui@mail.tust.edu.cn

通讯作者简介：

薛洁（1974—）（ORCID: 0000-0003-1916-0891），女，教授级高级工程师，博士，研究方向为发酵工程。E-mail: lxxuejie@126.com

钟成（1979—）（ORCID: 0000-0003-2691-0515），男，教授，博士，研究方向为合成生物学与生物反应工程。E-mail: czhong@tust.edu.cn

本文《非酿酒酵母Nakazawaea ishiwadae GDMCC 60786产乙酸乙酯的诱变菌株筛选及其安全性评价》来源于《食品科学》2023年44卷第10期165-172页，作者：马文瑞，孙志伟，石俊，张小娜，于佳俊，裴疆森，王德良，贾士儒，薛洁，钟成。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220919-172。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：东北农业大学食品学院 王梦蕊 ；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。

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