《食品科学》：中国农业科学院张春晖研究员等：牛骨肽钙螯合物制备、表征及其促MC3T3-E1细胞成骨活性

钙是人体中最丰富的无机元素之一，它主要分布在骨和牙齿中（约99%），在细胞增殖、神经传递和免疫反应等多种生理活动中发挥着重要作用 。钙缺乏可导致许多疾病，如骨质疏松症、肠癌和高血压 。目前，成人钙每日摄入量在800～1200 mg之间 。然而，我国大多数居民钙摄入量低于800 mg/d 。此外，通过饮食摄入增加身体中钙的储存一直是最有效的方法。因此，充足的口服钙摄入量对保持健康非常重要。碳酸钙是市场上一种广泛的钙补充剂，它以离子钙的形式被吸收。然而，在基本的肠道环境中，一些膳食因素（如草酸和植酸）导致的不溶性钙沉积，离子钙难以被吸收，最终钙的吸收和利用率较低 。此外，过量摄入碳酸钙可能导致胃肠道副作用，如便秘、胀气和腹胀 。肽钙螯合物由于其促进钙吸收的优势而被认为是一种潜在的膳食钙补充剂 。 目前，一些来自羊骨肽、鳕鱼骨肽、鸡骨肽、猪骨肽，已被用于制备肽钙螯合物以提高钙的吸收。

中国农业科学院农产品加工研究所的齐立伟、张春晖*等以牛骨肽（CPs）为原料，通过响应面方法确定制备CPs-Ca的最佳条件；运用多种光谱分析手段解析螯合前后结构差异及潜在结合位点；利用扫描电镜观察CPs螯合Ca前后的微观结构的变化；通过细胞实验，探究其对MC3T3-E1细胞的增殖、分化和矿化活性的影响，以期对肽钙螯合物工业化生产及应用提供理论依据。

1、单因素试验结果

前期研究表明，蛋白肽对钙的螯合能力可能与时间、pH值、温度、肽钙质量比等因素有关。在反应20 min后，随着螯合时间的延长，牛骨肽的钙螯合能力和肽钙螯合率没有明显变化（图1A）。pH值对牛骨肽的钙螯合能力影响较大，当pH 6增加至pH 8时，钙螯合能力从45.15 μg/mg增加到52.54 μg/mg，进一步提高溶液pH值时，钙螯合能力出现下降趋势（图1B）；此外，肽钙螯合率也呈现先增加后降低趋势。表明过高或者过低的pH值都不利于肽钙螯合反应的进行。温度是影响肽钙螯合能力的又一重要因素，随着温度的升高，钙螯合能力和肽钙螯合率呈现先增加后降低的趋势（图1C），并且在60℃时钙螯合能力和肽钙螯合率最高（钙螯合能力为54.51 μg/mg）。当肽钙比为3:1时，牛骨肽的钙螯合能力最强（钙螯合能力为53.52 μg/mg），随着肽钙比升高，钙螯合能力呈现降低趋势；相反，肽钙螯合率却呈现增加趋势（图1D），这可能是由于过高的肽钙比导致了Ca2+含量低于多肽中螯合位点，最终导致钙螯合能力下降，而肽钙螯合率升高。

2、响应面优化及结果

以螯合pH值（X1）、螯合温度（X2）和肽钙质量比（X3）为自变量，钙螯合能力为因变量（响应值Y），利用Design-Export 8.1软件对回归方程进行预测，预测最优螯合工艺为螯合温度62.54℃、肽钙质量比2.97:1、螯合pH 9.06，此时的钙螯合能力为（55.65±0.36）μg/mg。选择接近此条件的反应参数：在螯合pH 9、螯合温度62℃、肽钙质量比3:1条件下螯合0.5 h，做3组平行实验。结果表明在该条件下钙螯合能力为（54.98±0.42）μg/mg，与预测值无显著性差异（P＞0.05），说明在该条件下制备CPs-Ca的工艺可靠。

3、CPs-Ca结构表征分析

扫描电镜分析

如图2所示，CPs和CPs-Ca均呈现块状聚集体，且CPs-Ca的聚集体尺寸较大，表明CPs-Ca在微观结构上具有更显著的聚集性。可能的原因是钙离子可以通过加速肽的二聚化和稳定所得的二聚体进而促进聚集。此外，CPs的表面光滑、结构质密，表面有凹槽、孔洞，这可能是在快速真空冷冻干燥过程中产生的，然而CPs-Ca的表面较粗糙。主要原因可能是多肽与钙离子之间的配位键导致结构发生变化。

分子质量分布

牛骨肽与钙螯合后分子质量小于500 Da肽的占比从54.72%降至41.66%（P＜0.05）。分子质量500～1000 Da肽的占比从23.89%降至17.94%（P＜0.05）。相反，分子质量分布在2000～3000、3000～5000 Da和大于5000 Da肽的占比增加（图3）。可能原因是钙离子和肽之间形成新的螯合键，使肽交联形成大分子质量的螯合物。

红外光谱分析

如图4所示，吸收峰从3303.35 cm-1转移到3356.02 cm-1，这可能是由于CPs-Ca中存在伸缩振动和氢键的取代，表明O—H和N—H由于偶极场效应或诱导效应也参与了CPs-Ca的形成。1700～1500 cm-1的振动光谱区对应于酰胺I的伸缩振动（1700～1600 cm-1；C＝O）和酰胺II（1580～1510 cm-1；C—N，N—H）。在红外光谱中，酰胺I带（C＝O伸缩振动）的峰值从1649.50 cm-1变化到1654.70 cm-1，这与酰胺键（肽键）中碳基（C＝O）的伸缩振动有关。这些结果表明羧酸基参与了CPs-Ca的形成。同时，1430～1370 cm-1的振动光谱区域与羧酸基团（—COO - ）的伸缩振动有关。螯合钙后，红外光谱的峰值从1391.36 cm-1变化到1410.51 cm-1，表明—COO - 可能与钙结合，并转化为—COO-Ca。基于以上结果，推测多肽与钙的结合位点包括羧基氧、羟基氧和氨基氮原子。

X射线衍射分析

如图5所示，在肽的X射线光谱中存在一个弱衍射峰，表明肽呈随机的非晶结构。多肽与钙螯合后，CPs-Ca的光谱学发生了显著变化，有强而尖锐的衍射峰，这可能由于形成了新的有序晶体结构。结果表明，由于链的结合和结晶的形成，散射强度大大增加。

CPs-Ca稳定性分析

由图6A可知，不同的热处理组（40～90 ℃）钙保留率无显著差异，说明CPs-Ca在高温下稳定。由图6B可知，在pH值在2～7范围内，钙保留率随着pH增加而显著提高。以上结果表明，与酸性环境相比，CPs-Ca在中性条件下更稳定。这可能由于酸性条件下高浓度H + 可与钙离子竞争活性结合基团，从而促进CPs-Ca的解离。CPs-Ca中钙含量为54.9 μg/mg，经唾液、胃液和小肠液处理后钙含量分别为51.4、32.3 μg/mg和46.2 μg/mg（图6C）。CPs-Ca经口腔后受破坏较小，在胃中受到严重破坏，当受到严重破坏的CPs-Ca进入小肠后，小肠碱性环境又重新促进部分Ca2+与CPs再度螯合成CPs-Ca，但无法达到最初CPs-Ca中钙含量。

4、CPs-Ca促MC3T3-E1细胞成骨活性分析

CPs-Ca促MC3T3-E1细胞增殖效应

如图7A所示，CPs-Ca显著提高MC3T3-E1细胞的增殖活力，且在0.05～0.4 mg/mL质量浓度范围内，CPs-Ca促成骨细胞增殖效应与其质量浓度呈正相关。为了进一步探究CPs-Ca对MC3T3-E1细胞增殖的影响，研究MC3T3-E1细胞周期的分布。如图7B所示，与对照组相比，处于G0/G1阶段的MC3T3-E1细胞比例显著降低（P＜0.05），而处于S和G2/M阶段的MC3T3-E1细胞比例明显增加（P＜0.05）。这表明CPs-Ca可以诱导MC3T3-E1细胞从G0/G1期进入S和G2/M期，进而促进MC3T3-E1增殖。

CPs-Ca促MC3T3-E1细胞分化效应

ALP是MC3T3-E1细胞分化早期的产物，是测定其成骨活性的一个重要的指标，ALP活力的增加表示成骨细胞分化阶段的促进。对ALP进行组织化学染色以确定CPs-Ca对MC3T3-E1细胞成骨形成的影响。与对照组相比，CPs-Ca处理后的MC3T3-E1细胞中ALP阳性细胞的数量显著增加且蓝紫色更深，这表明CPs-Ca能显著提高成骨细胞ALP活力，促进成骨细胞分化（图8A）。此外，在0.05～0.4 mg/mL质量浓度范围内，CPs-Ca促成骨细胞分化效应与其质量浓度呈正相关。Ca2+可能通过TGF-β/Smad信号通路促进ALP基因表达。

CPs-Ca促MC3T3-E1细胞矿化效应

由图9A可知，MC3T3-E1细胞培养14 d后观察到明显的矿化结节，与对照组比较，用不同质量浓度CPs-Ca处理的细胞矿化结节数量更多且其染色程度更深，这表明CPs-Ca具有明显的促成骨细胞矿化作用。此外，在0.05～0.4 mg/mL质量浓度范围内，CPs-Ca促成骨细胞矿化效应与其质量浓度呈正相关（图9B）。Ca2+可能通过促进OPN和COL I基因表达进而促进MC3T3-E1细胞矿化。

结论

研究表明制备CPs-Ca的最优条件为肽钙质量比2.97:1、螯合温度62.54℃、螯合pH 9.06，此时钙螯合能力为55.65 μg/mg。钙离子可能与CPs中的氨基氮、羧基氧和羟基氧相互作用形成CPs-Ca，此过程改变了样品微观形态、分子质量分布等结构特点。CPs-Ca稳定性受温度影响较小，但对pH比较敏感，且小肠的弱碱性环境对已经被胃液严重破坏的CPs-Ca有一定修复作用。CPs-Ca具有显著促进MC3T3-E1细胞增殖、分化和矿化活性的作用，具有潜在的促成骨活性功效。本研究为制备新型补钙剂及其工业化生产和应用提供理论依据。

作者简介

通信作者：

张春晖，博士，研究员，博士生导师，国家“万人计划”科技创新领军人才，中国农业科学院“农科英才”，享受国务院特殊津贴专家。现承担国家自然科学基金、国家重点研发计划等课题10余项，先后获国家级、省部级科技进步奖励24项，发表论文120余篇（SCI/EI 50余篇），主编著作7部，授权专利72件，制定农业行业标准8项。科研成果在国内外50余家企业转化应用，取得了良好的经济社会效应。

第一作者：

齐立伟，男，硕士研究生（中国农业科学院农产品加工研究所），本科毕业于东北农业大学食品科学与工程专业，现研究方向为农产品加工及贮藏工程。

本文《牛骨肽钙螯合物制备、表征及其促进MC3T3-E1细胞成骨活性》来源于《食品科学》2023年44卷第6期107-115页，作者： 齐立伟，张鸿儒，郭玉杰，刘泓，李瑞林，张春晖，徐杨。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220319-226。点击下方 阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：延边大学农学院 田雨欣 ；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。

图片来源于文章原文及摄图网。

为进一步深入研究食品产业科技创新基础理论，保障食品质量与安全，研发具有营养和保健功能的食品，推动食品科学研究的进步，带动食品产业的技术创新，更好地保障人类身体健康和提高生活品质，北京食品科学研究院和中国食品杂志社《食品科学》杂志、《Food Science and Human Wellness》杂志在成功召开前十届“食品科学国际年会”和四届“食品科学与人类健康国际研讨会”及二十余次食品专题研讨会的基础上，将与国际谷物科技协会（ICC）、南京农业大学、南京财经大学、江苏省农业科学院、徐州工程学院、东南大学营养与食品卫生系于 2023年8月5-6日在中国江苏南京 共同举办“第十一届食品科学国际年会”。