中科院1区-山西大学揭示补阳还五汤对小鼠帕金森症的影响及机制

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导读

帕金森症（PD）是一种常见的、复杂的、涉及多系统的慢性神经退行性疾病。目前，治疗帕金森病的药物有很多局限性。补阳还五汤（BHD）是我国著名的中药方剂，在临床上用于治疗帕金森病。然而，其治疗机制尚不清楚。我们旨在通过整合肝脏代谢组和脑转录组分析，探索BHD缓解PD的药理学机制。我们用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）诱导PD小鼠；行为学测试和免疫组织化学用于评估BHD的神经保护作用；使用UHPLC-Q- Exactive MS/MS方法进行非靶向代谢组学分析，以分析肝脏中的差异累积代谢物（DAM）；在Illumina测序平台上通过转录组分析研究了大脑中的差异表达基因（DEGs）；使用综合代谢组学和转录组学方法研究了DAMs和DEGs的相关性。行为学测试和免疫组织化学的结果证明了BHD对PD症状的缓解作用。在正离子模式下，低剂量（L组）和高剂量（H组）BHD处理组分别检测到14和36个DAMs。与PD模型组（M组）相比，L组和H组共享三种富集途径，包括代谢途径、ABC转运蛋白和氨基酸生物合成。转录组学分析证明，BHD可以调节许多基因的表达，其中一些基因是多巴丝肼（Ben-Ldopa）靶向的，如Creb5、Gm45623、Ccer2、Cd180、Fosl2、Crip3和Noxred1。基于综合代谢组学和转录组学分析，我们在四个比较中发现了7个代谢产物基因对，并且嘌呤代谢、甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸代谢、苯丙氨酸代谢、光合生物中的碳固定、硫胺素代谢和ABC转运蛋白的这6个通路重叠。尽管BHD的潜在药理学机制仍然缺乏，但本研究表明，BHD可以通过调节肝脏代谢和大脑转录组来改善MPTP诱导的PD小鼠的多巴胺能神经元。

研究亮点：

1. 采用UHPLC-MS/MS对补阳还五汤的代表性活性成分进行了分析；

2. BHD可显著减轻MPTP诱导的帕金森症(PD)模型小鼠的症状；

3. BHD改变了PD小鼠肝脏组织的代谢组学特征；

4. BHD显著影响脑组织的整体转录组谱；

5. 多组学分析显示BHD与PD的肝、脑相关。

论文ID

原名：Integrated analysis of Metabolomic and Transcriptomic Profiling Reveals the Effect of Buyang Huanwu Decoction on Parkinson’s Disease in Mice

译名：结合代谢组学和转录组学分析，揭示补阳还五汤对小鼠帕金森症的影响

期刊：Phytomedicine

IF：6.656

发表时间：2023.03

通讯作者：李卓玉

通讯作者单位：山西大学生物技术研究所

实验设计

实验结果

1. BHD成分分析

本实验的设计示意图如图1所示。为了测定活性化学成分，我们通过UHPLC-MS/MS对BHD样品进行分析,BHD的组成由表1所示。正离子和负离子模式下BHD的总色谱图表明了所有化合物的化学组成（图2）。参考基于药理学的中药综合研究平台和关于BHD及其七种中草药化学成分分析的文献，我们筛选了BHD的潜在化合物，根据峰面积评估了每个化合物的相对含量，然后鉴定了15种具有代表性的成分（表3）。MS光谱如图S1和S2所示。

表1 BHD的组成

图1实验设计示意图

图2 BHD总离子色谱图

（A）正离子模式。（B）负离子模式

2. BHD减轻了PD小鼠的运动障碍

实验组别及处理如表2所示。我们进行爬杆试验以确定小鼠的运动缺陷。如图3A所示，MPTP处理（M组）延长了总运动活动时间（**p<0.01）。与M组相比，用BHD或Ben-Ldopa处理显著缩短了这一时间（##p<0.01），这表明BHD改善了MPTP诱导的运动缺陷。

表2实验组与处理

牵引试验是为了评估帕金森病小鼠的运动迟缓。结果表明，MPTP处理（M组）的力量下降，因为后爪握力得分较小，悬挂时间也比C组短（图3B，**p<0.01）。然而，BHD提高了握力得分和悬吊时间，这意味着BHD给药可能减轻MPTP诱导的初始病变（#p<0.05，##p<0.01）。Ben-Ldopa（P组）作为一种治疗PD的商业药物，也明显逆转了牵引评分和悬吊时间（##P<0.01）。因此，BHD可能改善PD小鼠受损的神经行为，其效果与Ben-Ldopa相似。

表3 BHD的代表性化合物

如图3C所示，在强迫游泳测试中，MPTP显著降低了FST得分（**p<0.01），阳性药物Ben-Ldopa（P组）与M组相比得分显著增加（P<0.01）。BHD可显著增加MPTP诱导PD大鼠的不动时间（P<0.01）。

图3 BHD对行为测试中PD表型的影响（n=10）

（A）爬杆测试。（B）牵引试验。（C）强迫游泳测试。**与C组相比，p＜0.01；#与M组相比，p<0.05，##p<0.01。

3. BHD可提高黑质TH的表达

越来越多的证据表明，广泛存在于纹状体中的多巴胺能神经元的轴突可以释放多巴胺，从而调节运动功能。多巴胺能神经元的损伤或丧失会导致运动功能障碍。为了阐明运动性能的改善是否是由于BHD对多巴胺能神经元的调节，我们对多巴胺能神经细胞的标志物酪氨酸羟化酶（TH）进行染色以评估神经元损伤。如图4A和B所示，与C组相比，MPTP诱导 黑质（ SNs）中TH染色密度和TH阳性神经元明显降低（p<0.01），而BHD处理（L组和H组）显著增加了SN中的TH阳性神经元（p<0.01）。此外，实时PCR的结果（图4C）也表明，与C组相比，MPTP处理显著降低了Th mRNA水平，而BHD处理（L组和H组）与M组相比，Th mRNA水平显著升高（p＜0.001）。因此，BHD可能促进PD小鼠多巴胺能神经元的存活，从而改善运动性能。

图4口服BHD增加了MPTP处理的小鼠（n=3）的TH水平

（A）大脑的组织病理学分析。（B）SN中TH阳性细胞的鉴定（单侧SN）。（C）通过实时PCR检测脑中Th mRNA的相对表达。与C组相比，**p＜0.01；与M组相比，##p＜0.01。

4. BHD对PD小鼠肝脏代谢产物谱的影响

PLS-DA方法用于分析PD小鼠肝脏代谢组学图谱的变化。因此，在正离子（图5A、B、C和D）和负离子（图S3A、B、C和D）模式下，五组被清楚地分离。R2Y（0.997 C vs M；0.99 M vs P；0.951 M vs L；0.997 M vs H）和Q2（0.709 C vs M、0.113 M vs P、0.545 M vs L、0.904 M vs H）证明分析模型预测的准确性。

根据PLS-DA模型中VIP>1和p<0.05的标准，与C组相比，M组在正离子模式下鉴定出18个DAMs，包括D-脯氨酸的减少和其他17种代谢物的增加（图5E和表S2）；而在负离子模式下鉴定出4种DAMs减少，包括绿原酸、奎宁酸、1-oleoyl-sn-glycerol 3-phosphate和辛酸，其他50种DAMs增加（图S3 E）。Ben-Ldopa干预后，14种代谢产物的丰度显著下降，其中正离子模式下有2个（图5F和表S3），负离子模式下有12个（图S3F）。此外，一种代谢产物在负离子模式下增加（图S3 F）。马尿酸、糖精、苯乳酸、异丁酰甘氨酸和D-核糖-5-磷酸等5种DAMs的丰度在M组明显增加（M与C相比，p<0.05），并在Ben-Lopa的干预下趋于恢复到C组的丰度（p与C相比（p>0.05）。与M组相比，在正离子模式下，L组和H组分别鉴定出14个和36个DAMs。其中，L组和H组分别有13和31种代谢产物下调，1和5种代谢产物上调（图5G和H）。此外，在负离子模式下，L组和H组分别有27和17种代谢产物下调，1和2种代谢产物上调（图S3 G和H）。与M组相比，L组的12个DAMs的丰度（M与C，p＜0.05）通过低剂量的BHD调整到C组的正常水平（L与C，p＞0.05）。这12种DAMs包括烟酰胺、糖精、L-苏糖酸、20-羟基-PGF2a、Phynolactic acid、羟嘌呤醇、异丁酰甘氨酸、L-苏氨酸、L-苯丙氨酸、鸟苷二磷酸甘露糖、γ-L- Glutamil-L- 谷氨酸和L-古洛糖酸-γ内酯（表S4）。在H组中，高剂量的BHD恢复了8种DAM的丰度（M与C，p＜0.05），包括L-精氨酸、N-α-乙酰-L-精氨酸，谷胱甘肽二硫化物、D-脯氨酸、 马尿酸、 γ-L- Glutamil -L-谷氨酸、5'-单磷酸鸟苷（GMP）和1-脱氧-D-酰果糖-5-磷酸（表S5）（H与C，p＞0.05）。尽管Ben-Ldopa和BHD对PD都有显著的治疗作用（图3和图4A），但与M组相比，P组的DAMs低于L或H组，表明BHD可以影响更多代谢物的丰度。

所有的DAM都映射到KEGG数据库（图5I、J、K和L）。图5I显示了M组中前11个富集途径，包括代谢途径、ABC转运蛋白、氨基酸（特别是缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸）的生物合成、蛋白质消化和吸收、氨酰基tRNA生物合成、矿物质吸收、C5支链二元酸代谢，丙酮酸代谢和由鸟氨酸、赖氨酸和烟酸衍生的生物碱的生物合成。其中，前3条途径，包括代谢途径、ABC转运蛋白和氨基酸生物合成，也受到低剂量和高剂量BHD的影响（图5K和L）。半乳糖代谢、果糖和甘露糖代谢、组氨酸和嘌呤衍生的生物碱生物合成、嘌呤代谢、烟酸和烟酰胺代谢以及磷酸转移酶系统（PTS）与低剂量BHD有关（图5K），高剂量BHD影响精氨酸和脯氨酸代谢、尼古丁成瘾、GABA能突触、肌萎缩侧索硬化症（ALS）、双组分系统、丁酸代谢和突触囊泡周期（图5L）。在P组中，有6种显著富集的途径（P<0.05），包括苯丙氨酸代谢、嘌呤代谢、不同环境中的微生物代谢、甲状腺激素合成、光合生物中的碳固定和硫胺素代谢（图5J）。KEGG途径的详细信息列于表S6中。

图5正离子模式下的代谢组学分析（n=6）

（A、B、C和D）两组（包括C和M、M和P、M和L、M和H）之间的PLS-DA评分图。（E、F、G和H）包括C和M、M和P、M和L以及M和H之间两组DAM的热图分析。（I、J、K和L）包括C和M、M和P、M和L以及M和H在内的两组DAM的KEGG通路富集分析。

5. BHD对PD小鼠脑转录谱的影响

对脑组织的转录组学分析显示，在MPTP处理的小鼠中，BHD引起显著变化（图6）。通过应用|log2FoldChange|>1和p值<0.05的截止值，我们对DEG进行筛选。火山图显示了DEG的总体分布（图S4A、B、C和D）。与C组相比，43个基因集被MPTP显著改变，其中12个上调，31个下调（表S7）。与M组相比，L组发现112个DEG，其中87个上调，25个下调（表S8）。高剂量BHD组（H组）有50个基因差异表达，其中23个上调，27个下调（表S9）。阳性药物Ben-Ldopa改变了210个基因的表达，其中148个上调，62个下调（表S10）。我们在通过分层聚类分析的热图中绘制显著差异表达的基因（图6A），表明各组DEG表达有显著差异。DEG也显示在维恩图中（图6B）。P组和M组相比，有7个DEG重叠，包括Creb5、Gm45623、Ccer2、Cd180、Fosl2、Crip3和Noxred1（表S11），表明它们可能在BHD和Ben-Ldopa减轻PD症状中发挥关键作用。为了鉴定转录谱的结果，我们通过实时PCR测定了五个基因的mRNA水平，包括Fosl2、Creb5、Cd180、Ccer2和Gm45623（图S5）。因此，Fosl2的表达水平在M组中上调，并被Ben-Ldopa（P组）和BHD（L和H组）降低。相反，Creb5、Cd180、Ccer2和Gm45623的表达均被MPTP（M组）降低，但被Ben-Ldopa（P组）和BHD（L和H组）升高。

为了确定BHD影响的潜在途径，我们使用KEGG数据库分析DEG的生物功能。前20个最重要的通路以散点图的形式呈现（图6C、D、E和F）。与C组相比，MPTP调节的信号通路主要与基因表达（内质网中的剪接体和蛋白质加工）的调节，物质代谢（矿物质吸收、蛋白质消化和吸收、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和组氨酸代谢、醚脂代谢、甘油代谢、胆固醇代谢和初级胆汁酸生物合成），热量限制（多种长寿调节途径），细胞生长（Hedgehog信号通路、MAPK信号通路和雌激素信号通路），免疫调节（内分泌和抗原处理和呈递）以及人类传染病（甲型流感、军团菌病、弓形虫病和麻疹）有关（图6C）。受Ben-Ldopa影响的KEGG途径与成瘾（可卡因成瘾、苯丙胺成瘾和酒精中毒），物质代谢（蛋白质消化和吸收、酪氨酸代谢、D-精氨酸和D-鸟氨酸代谢、苯丙氨酸代谢、维生素消化和吸收以及叶酸生物合成），感染性疾病（人乳头瘤病毒感染），遗传性疾病（年轻人的成熟期糖尿病），神经传导（帕金森病、钙信号通路、神经活性配体受体相互作用、多巴胺能突触和血清素能突触）和多种生理过程（甲状旁腺激素的合成、分泌和作用、Apelin信号通路、ECM-受体相互作用和cGMP-PKG信号通路）有关（图6D）。与M组相比，低剂量BHD恢复了五种途径，包括蛋白质消化和吸收、矿物质吸收、醚脂代谢、长寿调节途径和雌激素信号传导途径（图5E）。此外，与神经系统相关的几种途径也发生了改变，如松弛素信号通路、局灶性粘附、PI3K-Akt信号通路、ECM受体相互作用、甲状旁腺激素合成、分泌和作用、HIF-1信号通路、甲状腺激素合成和TNF信号通路。其中，前五种途径也受到高剂量BHD的影响（图5F）。P组和H组的维生素消化吸收和可卡因成瘾两种途径都发生了变化。此外，高剂量BHD调节了几种神经退行性疾病相关途径，例如铁死亡、吞噬体、肌动蛋白细胞骨架的调节和破骨细胞分化。H组还涉及三种癌症相关通路（乳腺癌症、胃癌和癌症通路）。详细的通路参数如表S12所示。

图6不同组脑组织中DEG的图谱（n=3）

（A）来自不同组DEGs的聚类热图，行表示DEG，列表示样本。红点表示变化（红色表示上调；绿色表示下调；蓝色表示无变化）。列表示在不同组中显著上调（红色）或下调（绿色）的每个基因集。（B）不同组比较中显著富集的DEG的维恩图代表了独特和重叠的DEG。（C、D、E和F）KEGG通路数据库中分别富集了M与C、P与M、L与M和H与M的DEG。

6. 帕金森病小鼠代谢组和转录组的综合分析

为了进一步研究大脑转录组和肝脏代谢组之间的相关性，我们将DEGs（p<0.05）和DAMs（p<0.05）映射到KEGG数据库中。代谢产物基因对在四个比较中，包括C与M、M与p、M与L和M与H，p＜0.05，如图7所示。包括L-苏氨酸_Desi1和磷酸乙酰胺_Enpp6在内的两对在C和M之间呈负相关（图7A）。核糖-5-磷酸_Pgm1在M和P之间呈正相关（图7B）。在M与L的比较中，Alpl与一磷酸硫胺素呈负相关，但与甘油磷酸呈正相关（图7C）。包括L-谷氨酸_Gpt2和甘油磷胆碱_Pnpla7在内的两对在M和H之间均呈正相关（图7D）。补充表S13列出了这些代谢产物基因对的详细信息。

图7四种比较中的代谢产物基因对

(A) C与M。(B)M与P。(C) M与L。(D) M与H。

为了探索不同组中改变的共同途径，我们将DEGs（p<0.05）和DAMs（p<0.05）映射到KEGG数据库中，并使用R中的pathview包进行可视化。与C组相比，M组富集了89条途径（表S14）。其中，32条途径位于L组和H组（表S15），其中6条也位于P组，包括嘌呤代谢、甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸代谢、苯丙氨酸代谢、光合生物中的碳固定、硫胺素代谢和ABC转运蛋白（表S16）。结果表明，这32条通路可能对BHD改善帕金森至关重要。其中6种不仅在BHD缓解PD症状中发挥作用，而且在Ben Ldopa保护多巴胺神经元中发挥重要作用。在M组中富集的10种途径仅在L组中富集，但在H或P组中未富集（表S17），而另外34种途径仅位于H组中，但在L或P组未富集（图S18）。这意味着低剂量和高剂量的BHD可能会影响不同的信号通路。L组和H组富集了6种途径，包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、淀粉和蔗糖代谢、甘油代谢、产热、碳水化合物消化和吸收以及胆汁分泌（表S19），但M组未富集。

帕金森被认为是一种主要以运动功能障碍为特征的运动障碍，但现在它被认为是多系统疾病，与睡眠和胃肠功能障碍等各种非运动症状有关。MPTP通过抑制能量代谢诱导多巴胺神经元死亡，已被广泛用于帕金森症相关研究。在目前的研究中，我们通过实时PCR证明了MPTP通过ICH（图4A和B）和TH mRNA水平（图4C）促进了PD小鼠脑中TH阳性神经元的损失。给予BHD恢复了TH的表达并增加了TH阳性神经元。在本研究中，Ben-Ldopa（Madopar）处理也出现了类似的结果，尽管尚不清楚Ben-Ldoba是否会影响SNs中TH的表达。然而，我们的研究结果表明，BHD保护DA神经元对抗MPTP，这可能是BHD改善PD小鼠运动能力的原因（图3）。此外，MPTP显著影响肝脏中的50种代谢途径，包括氨酰基tRNA、氨基酸、蛋白质、C5支链二元酸、丙酮酸、生物碱、矿物质等（表S6）。与帕金森病进展相关的嘌呤代谢受到MPTP的干扰，并受到Ben-Ldopa和低剂量或高剂量BHD的调节。甲状腺激素调节受损与帕金森病的严重程度和不同亚型有关，硫胺素代谢产物可能是帕金森症等神经退行性疾病的生物标志物。我们的研究结果表明，Ben-Ldopa和低剂量或高剂量BHD恢复了受MPTP影响的甲状腺激素合成和硫胺素代谢。此外，在药物诱导的肝损伤中发挥重要作用的ABC转运蛋白在M组发生了改变（图5I），并通过BHD处理在一定程度上恢复（图5K和L以及表S6），提示MPTP诱导的小鼠PD伴有肝功能障碍，BHD可以改善这种情况。半乳糖诱导的氧化应激可能是PD的可能原因之一。MPTP异常激活半乳糖代谢，而低剂量BHD抑制其活性（图5K和表S6）。因此，与Ben-Ldopa相比，BHD具有不同的分子靶标。

小鼠大脑中的转录组学分析直接证明了帕金森病的发病机制以及Ben-Ldopa和BHD的治疗机制。我们的研究结果表明，MPTP广泛影响小鼠大脑中基因表达和蛋白质/氨基酸稳态，其中与细胞增殖相关的几种重要途径（Hedgehog、MAPK和雌激素）受到显著影响。Ben-Ldopa在一定程度上恢复了与蛋白质代谢相关的多种途径。在给予低剂量或高剂量BHD后，更多与物质代谢和细胞生长相关的信号通路受到调节。值得注意的是，高剂量BHD也影响与神经退行性疾病相关的多种信号通路（图6F）。例如，脂质氧化诱导的铁死亡可能是帕金森病神经变性的重要原因。参与脑内补体系统的吞噬体与帕金森病的发病机制有关。肌动蛋白细胞骨架信号传导已被证明有助于CHIP的神经保护功能，CHIP是一种E3泛素连接酶。骨丢失是帕金森症的一种非运动症状，成骨细胞和破骨细胞数量和活性的失衡可能是直接原因。这些结果表明，BHD具有多个靶点，这有助于其缓解帕金森症状的明显效果。

我们综合肝脏代谢组和脑转录组分析证明了几种代谢产物基因对，并将PD小鼠的肝脏和大脑这两个重要器官联系起来。低剂量或高剂量BHD调节PD小鼠中总共32条改变的途径，其中许多涉及能量代谢、脂肪代谢、蛋白质和氨基酸稳态以及碳水化合物代谢。在这里，我们发现了6个代谢产物基因对。目前，其中五种已被证明与中枢神经系统的发育有关。例如，外核苷酸磷酸二酯酶/焦磷酸酶6（Enpp6）是一种碱性溶血磷脂酶C，与成熟髓鞘的发育有关。磷酸葡萄糖变位酶-1（Pgm1）的去磷酸化导致糖酵解的减少，糖酵解对大脑中的能量产生至关重要，有助于学习和记忆。Alpl基因编码的组织非特异性碱性磷酸酶（TNAP）是一种通过糖基磷脂酰肌醇（GPI）部分与细胞膜结合的胞外酶，调节脑微血管的形成。Alpl基因的突变可能诱发低磷酸盐血症（HPP）。线粒体酶谷氨酸-丙酮酸转氨酶2（GPT2）的缺失可能导致蓝斑（LC）的变性，致使AD和PD。含有Patatin样磷脂酶结构域的蛋白7（PNPLA7）也被称为神经病变靶酯酶相关酯酶，在脑功能中具有关键功能。Desi1基因编码一种新的deSUMOylating酶，它被推测为去泛素化异肽酶PPPDE超家族的成员，但迄今为止尚未报道其在神经系统中的功能。我们的研究结果表明，肝脏中L-苏氨酸、磷酸乙醇胺、核糖-5-磷酸和硫胺素一磷酸的水平分别与大脑中Desi1、Enpp6、Pgm1和Alpl的表达呈负相关，而肝脏中磷酸甘油酮、L-谷氨酸和甘油磷酸胆碱的水平分别与大脑中的Alpl、Gpt2和Pnpla7呈正相关（表S13）。KEGG通路分析表明，ABC转运蛋白和嘌呤、硫胺素以及包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸和苯丙氨酸在内的几种氨基酸的代谢可由BHD和Ben-Ldopa调节（表S16）。这些结果与代谢组分析结果一致（图5）。因此，BHD缓解PD的可能机制是，BHD影响肝脏代谢，然后改变的代谢产物有助于DA神经元的功能（图8）。

图8 BHD缓解PD的可能机制

结论

在本研究中，我们通过行为测试和免疫组织化学证实了BHD可以有效缓解MPTP诱导的小鼠帕金森病。BHD调节了代谢途径、ABC转运蛋白和氨基酸生物合成的肝脏代谢产物的丰度，并改变了主要参与松弛素信号通路、局灶性粘附、PI3K-Akt信号通路、ECM受体相互作用以及甲状旁腺激素合成、分泌和作用的脑基因的表达水平。综合肝脏代谢组和大脑转录组显示，6个代谢产物基因对，包括L-苏氨酸_Desi1、磷酸乙酰胺_Enpp6、核糖-5-磷酸酯_Pgm1、硫胺素单磷酸_Alpl、甘油磷酸酯_Alpl、L-谷氨酸_Gpt2和甘油磷胆碱_Pnpla7，以及32个主要参与能量代谢、脂肪代谢、蛋白质和氨基酸稳态以及碳水化合物代谢的途径，可能对BHD改善PD至关重要。因此，了解肝脏和大脑之间的关系对于揭示BHD改善PD的治疗机制可能很重要。然而，我们的组学研究主要基于小鼠肝脏和大脑，在未来的研究中需要对这两个器官在PD中的联系进行更详细的分析。

https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0944711323001137

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