FSHW | 不同抗原表位氨基酸的差异可能会导致鸡蛋和鹌鹑蛋卵类黏蛋白的不同致敏性

Introduction

食物过敏是对食物中特定蛋白质的一种免疫介导的超敏反应，近年来，西方国家中幼儿患食物过敏的约有5%～8％，成年人达到2%～4％，逐渐成为一个日益严重的问题。据估计，鸡蛋过敏的发生率超过牛奶，是欧美国家儿童最常见的速发型食物过敏反应。尽管鸡蛋中卵白蛋白含量最高（54%），但卵类黏蛋白（11%）是引起过敏反应的主要原因之一。鸡蛋卵类黏蛋白具有热稳定性和消化酶稳定性，导致一些鸡蛋过敏患者对煮熟的鸡蛋不耐受。已有研究指出，经胃蛋白酶消化后的卵类黏蛋白肽段仍具有抗原性，说明卵类黏蛋白的线性表位构成其抗原性。目前，在鸡蛋卵类黏蛋白中，已鉴定出9个IgE线性表位。先前的研究报告称，由鹌鹑蛋制成的专利混合膳食补充剂可以快速有效地缓解最常见的室外和室内过敏原引起的过敏性鼻炎症状，且没有不良事件。有研究者发现鹌鹑蛋可缓解花生过敏引起的体内嗜酸性食管炎，并通过调节蛋白酶活化受体-2（PAR-2）的表达，减少了胰蛋白酶和嗜酸性阳离子蛋白的释放。除此之外，研究发现鹌鹑蛋的卵类黏蛋白可作为丝氨酸蛋白酶抑制剂，对嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞的活化具有抑制作用，而对包括鸡蛋在内的10种禽蛋的卵类黏蛋白则无抑制作用。然而，鸡蛋和鹌鹑蛋中卵类黏蛋白功能差异的原因尚不清楚。

鉴于针对鹌鹑蛋卵类黏蛋白的过敏病例尚无报道，本文采用多种生物信息学方法对鹌鹑蛋和鸡蛋卵类黏蛋白的序列进行比较，以确定其氨基酸组成和序列的相似性结果发现，虽然鹌鹑蛋和鸡蛋卵类黏蛋白的氨基酸序列相似性很高，但大部分差异氨基酸分布在9个IgE线性表位上。用鸡蛋过敏患者血清进行血清学检验，发现两种蛋白无IgE交叉反应。此外，为了进一步研究鹌鹑蛋中的特定成分发挥抗过敏作用，我们发现鹌鹑蛋中的卵类黏蛋白抑制RBL-2H3细胞脱颗粒，保护形态。综上所述，我们的结果表明，鹌鹑蛋中的卵类黏蛋白的致敏性低于鸡蛋，并且在过敏反应阶段对嗜碱性粒细胞的脱颗粒具有调节作用。

Results and Discussion

鹌鹑蛋和鸡蛋卵类黏蛋白物化性质和功能性质的比较

NCBI数据库中获得鹌鹑蛋（XP_015731887.1）和母鸡蛋（NP_001295423.1）中卵类黏蛋白的氨基酸全序列，其理化性质如表1所示。两种蛋白质均由210个氨基酸组成，分子量和pI相近。ExPASy预测鹌鹑卵磷脂不稳定指数为40.35，高于母鸡卵磷脂的不稳定指数。结果表明，来自鸡蛋的卵形蛋白是一种稳定蛋白，而来自鹌鹑的卵形蛋白是一种不稳定蛋白。

如图1所示，组成两种卵类黏蛋白的氨基酸类型为19种，缺少色氨酸。与鸡蛋卵类黏蛋白相比，鹌鹑蛋卵类黏蛋白中Glu、Thr和Tyr的比例升高，而Ala、Asp和Leu的比例降低。氨基酸组成的差异可能会影响蛋白质的空间结构或序列上的结合位点。

两种卵类黏蛋白均有3个kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂结构域，位于相似的位置，如表2所示。与鸡蛋卵类黏蛋白相比，鹌鹑蛋卵类黏蛋白中的AA172-173也是一个胰蛋白酶结合位点。

表1 卵类黏蛋白的理化性质

表2 两种卵类黏蛋白kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂结构域的比较

图1 卵类黏蛋白氨基酸组成分析

鹌鹑蛋与鸡蛋卵类黏蛋白同源性分析

将这两个氨基酸序列进行BLAST比对，相似性达到77%（162/210）。在SDPA变应原数据库中进行了变应原预测，只有Gal d 1（母鸡卵类黏蛋白）与鹌鹑卵卵磷脂具有同源性（E＝1.6×10 −68 ，E＜0.01表示同源性），表明在一级结构水平上，鹌鹑蛋卵类黏蛋白仅与变应原数据库中母鸡卵类黏蛋白具有同源性，但两者在结构上的差异有待进一步分析。虽然鸡蛋卵类黏蛋白（Gal d 1）是已知的主要过敏原，与鹌鹑蛋卵类黏蛋白相似率77%。食物过敏反应通常是由于过敏原与抗体的结合而引起的，与抗体结合的表位的不同也会显著影响同源蛋白的过敏原性。

从SDAP数据库中获得9个IgE表位，如表3所示。在9个表位中，有8个表位具有两个蛋白质中不同的氨基酸。鹌鹑蛋和鸡蛋卵类黏蛋白的氨基酸组成差异可能会改变原表位或影响空间结构，从而降低致敏性。

表3 鸡蛋卵类黏蛋白中的IgE结合的线性表位

卵类黏蛋白结构分析

两种卵类黏蛋白的整体疏水性相似。疏水性区域主要分布在信号肽区（AA0−24），AA24−210的疏水性较差（图2a，b）。两种卵类黏蛋白的亲水区域分布相似（图2c，e）。在AA45-65和AA170-180中，鸡蛋卵类黏蛋白的可塑性高于鹌鹑蛋卵类黏蛋白，更容易发生折叠和弯曲。与鹌鹑蛋卵类黏蛋白相比，鸡蛋卵类黏蛋白的AA115-125和AA130-140抗原指数较高。

在二级结构方面，这两个蛋白中的4种结构形式的比例相似，主要是随机卷曲，α-螺旋和β-折叠的总比例仅为30%左右。鹌鹑蛋中的AA13-14、AA21-23、AA42-43、AA71-72、AA88-87和AA145-146均为随机卷曲，而不是β-折叠。相比之下，鹌鹑蛋中的AA25−27、AA115−118和A157−159是由随机卷曲转变为β-折叠（图2d，f）。尽管每个结构的比例是相似的,但是两种蛋白质的结构分布是不同的，这可能是导致两种蛋白质不同致敏性的原因。

图2 卵类黏蛋白的序列性质及二级结构分析。鹌鹑（a，c，d）和鸡蛋（b，e，f）卵类黏蛋白的疏水性分析（a，b）、序列分析（c，e）和二级结构分析（d，f）

两种卵类黏蛋白的差异氨基酸的空间位置分布

利用Pymol软件，在三维模型上定位9个已知的鸡蛋卵类黏蛋白的IgE线性表位，如图2所示。AA27-86中有3个表位肽（左），主要位于α-螺旋、β-折叠和随机螺旋中，但在粉色（α-螺旋）和绿色（随机螺旋）中，存在差异氨基酸。AA90-151（中）中有4个表位，主要位于随机螺旋状、与α-螺旋、β-折叠和β-转角处。AA155-210位点有两个表位（右），分别位于α-螺旋和β-折叠上，差异氨基酸均位于随机螺旋和α-螺旋连接处。一般来说，鸡蛋卵类黏蛋白的抗原表位大多位于β-折叠、α-螺旋和随机螺旋的连接处。而在鸡蛋卵类黏蛋白的9个IgE表位中，有8个表位含有与鹌鹑蛋卵类黏蛋白不同的氨基酸。表位氨基酸的差异和二级结构的不同分布可能会影响到蛋白质和表位的局部三维结构，甚至影响蛋白质的功能。

图3 卵类黏蛋白的三维结构和氨基酸定位。从左到右分别为AA27−86、AA90−151和AA155−210中的区域。粉红色、蓝色、绿色和紫色表示表位。这两种蛋白质中相似的氨基酸用黄色表示，不同的氨基酸用红色表示

卵类黏蛋白的胰蛋白酶抑制活性

为了评价鹌鹑蛋和鸡蛋卵类黏蛋白对胰蛋白酶的抑制作用，与对照组相比，鸡蛋卵类黏蛋白、鹌鹑蛋卵类黏蛋白和胰蛋白酶抑制剂均能显著抑制胰蛋白酶反应，如图4所示，表明重组鹌鹑蛋卵类黏蛋白可以正常折叠形成胰蛋白酶抑制结构域。

图4 鹌鹑蛋和鸡蛋卵类黏蛋白对胰蛋白酶活性的抑制作用

鹌鹑蛋卵类黏蛋白的潜在过敏原性评价

为了评估鹌鹑蛋卵类黏蛋白的潜在过敏原性，采用Western blot方法检测了两种卵类黏蛋白对鸡蛋过敏患者血清池的结合能力，如图5所示。鸡蛋卵类黏蛋白可以与鸡蛋过敏患者血清结合。但未发现鹌鹑蛋卵类黏蛋白与同一血清结合，说明鹌鹑蛋卵类黏蛋白基本不致敏。

M. marker；1.鸡蛋卵类黏蛋白；2.鹌鹑蛋卵类黏蛋白。

图5 卵类黏蛋白与鸡蛋过敏患者血清池结合能力的评价

卵类黏蛋白对RBL-2H3细胞释放β-己糖胺酶的影响

测定了两种卵类黏蛋白对RBL-2H3细胞活性的影响（图6a）。鹌鹑蛋和鸡蛋（100、250、500、1000 μg/mL）的卵类黏蛋白对细胞活力无显著影响，可用于后续实验。

为了测定刺激RBL-2H3细胞脱颗粒的C48/80浓度，采用不同浓度的C48/80（0、40、80、100、120 μg/mL）刺激细胞脱颗粒（图6b）。不同浓度的C48/80处理组β-己糖胺酶释放量与Triton X-100组极显著差异（P＜0.01），且显著高于对照组。不同浓度的C48/80组之间没有显著差异。120 μg/mL时，β-己糖胺酶在细胞内的释放率最高，达38%。采用120 μg/mL C48/80刺激RBL-2H3细胞，研究鹌鹑蛋和蛋类卵类黏蛋白对嗜碱性粒细胞释放颗粒物质的影响。在100～1000 μg/mL剂量范围内，鹌鹑蛋卵类黏蛋白对RBL-2H3释放β-己糖胺酶具有显著的抑制作用。当鹌鹑蛋卵类黏蛋白浓度为1000 μg/mL时，β-己糖胺酶的抑制率优于胰蛋白酶抑制剂组，表明不同浓度的鹌鹑卵黏液均能抑制RBL-2H3细胞的脱颗粒。低浓度的鸡蛋卵黏液（100、250、500 μg/mL）能极显著抑制β-己糖苷酶的释放，而1000 μg/mL时对β-己糖苷酶水平无影响（图6c）。

不同处理下细胞形态的变化与β-己糖胺酶的释放速率一致（图6d）。RBL-2H3脱颗粒后，细胞形态由梭形转变为圆形。鹌鹑蛋卵类黏蛋白（100、250、500、1000 μg/mL）能保护RBL-2H3细胞形态，且随着浓度的增加，梭状细胞比例显著增加，这与脱颗粒实验结果一致。鸡蛋卵类黏蛋白对细胞形态没有明显的保护作用。

图6 卵类黏蛋白对RBL-2H3细胞活性、脱颗粒和形态的影响

Conclusion

综上所述，本研究表明鹌鹑蛋与鸡蛋卵类黏蛋白的氨基酸差异主要存在于鸡蛋卵类黏蛋白的IgE线性表位中。二者二级结构的差异可能导致空间结构的变化。从GS115毕赤酵母系统中获得的重组鹌鹑蛋卵类年单笔具有抑制胰蛋白酶的活性。重组鹌鹑蛋卵类黏蛋白与鸡蛋卵类年单笔之间未发现IgE交叉反应。重组鹌鹑蛋卵类黏蛋白抑制RBL-2H3细胞脱颗粒，保护细胞形态，对过敏性疾病具有潜在的治疗作用，丰富了鹌鹑蛋的营养和功能特性，也促进了过敏性疾病的防治。对于鸡蛋卵类黏蛋白过敏的人，鹌鹑蛋可能是鸡蛋的一个很好的营养替代品。

通信作者

车会莲，女，中国农业大学食品科学与营养工程学院教授，博士生导师，中国农业大学特殊食品研究中心，常务副主任，农业农村部农产品质量监督检验测试中心（北京），副主任。2005年以来一直致力于食物营养、食品过敏、食品安全性评价等领域的研究，尤其是在食物致敏原的鉴定、致敏性评估、过敏机理及抗过敏功能等研究方面，取得了一批具有领先水平的研究成果；同时，在保健食品、婴幼儿配方食品和特殊医学用途配方食品的研发、评价、咨询等方面也开展了很多工作。十余年来，主持各类国家级、省部级科研项目10余项、申请专利21件、7项已经获得了授权，2项实现了转化，获得软件著作权10件、参与制定国家标准5个，在国内外学术刊物上发表论文百余篇。

The amino acids differences in epitopes may promote the different allergenicity of ovomucoid derived from hen eggs and quail eggs

Mengzhen Hao, Shuai Yang, Shiwen Han, Huilian Che*

Key Laboratory of Precision Nutrition and Food Quality, Key Laboratory of Functional Dairy, Ministry of Education, College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China

*Corresponding author.

Abstract

Quail egg ovomucoid can inhibit activation of basophils and eosinophils, while hen egg ovomucoid has been shown to be a major allergen, named Gal d 1. At present, the differences in structure and function between two ovomucoid are unclear. We found the homology of ovomucoid in quail eggs and hen eggs reached 77 %. Compared with hen egg ovomucoid, the distribution of secondary structure was different in AA52−53, AA57−58, AA66−68, AA71−72, AA131−133, AA139−140, AA157−159 and AA184−185. Among 9 epitopes of egg ovomucoid, there were different amino acids from quail egg ovomucoid in 8 epitopes. Recombination quail egg ovomucoid had trypsin inhibition activity and quail egg ovomucoid didn’t specifically bind to serum of eggs allergic patients. Quail egg ovomucoid can significantly inhibit RBL-2H3 cells degranulation and protect cells morphology to a certain extent, indicating quail egg ovomucoid can inhibit cells activation and have potential anti-allergic effects, which is related to trypsin inhibitory activity. The difference in sensitization compare to hen egg ovomucoid may be due to amino acids differences affecting protein structure by changing antigenic epitopes.

Reference:

HAO M Z, YANG S, HAN S W, et al. The amino acids differences in epitopes may promote the different allergenicity of ovomucoid derived from hen eggs and quail eggs[J]. Food Science and Human Wellness, 2023, 12(3): 861-870. DOI:10.1016/j.fshw.2022.09.028.

文章编译内容由作者提供

编辑：梁安琪；责任编辑：张睿梅

Food Science of Animal Products（ISSN: 2958-4124, e-ISSN : 2958-3780）是一本国际同行评议、开放获取的期刊，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心主办，中国食品杂志社《食品科学》编辑团队运营，属于食品科学与技术学科，旨在报道动物源食品领域最新研究成果，涉及肉、水产、乳、蛋、动物内脏、食用昆虫等原料，研究内容包括食物原料品质、加工特性，营养成分、活性物质与人类健康的关系，产品风味及感官特性，加工或烹饪中有害物质的控制，产品保鲜、贮藏与包装，微生物及发酵，非法药物残留及食品安全检测，真实性鉴别，细胞培育肉，法规标准等。

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