《食品科学》：青岛农业大学陈海华教授等：热诱导温度与pH值对乳清浓缩蛋白凝胶结构和性质的影响

乳清浓缩蛋白（WPC）是指从巴氏杀菌的乳清中去除非蛋白成分后的乳清产品，是乳制品行业的副产物，是必需氨基酸的极好来源。乳清蛋白因具有发泡、包封、凝胶和乳化等优良功能和营养特性，在食品工业中得到了广泛的应用。目前，乳清蛋白已被应用于婴儿配方奶粉、烘焙产品、糖果、水果饮料、功能食品（运动饮料、营养品、减肥产品）和药品中。乳清蛋白最显著的功能特性之一是能够通过热诱导形成可固定大量水和其他食物成分的黏弹性凝胶，从而改善食品的外观、质地和性能，常被用作制备可食用凝胶。蛋白凝胶网络还能够保护和传递生物活性分子，提高其利用率。

青岛农业大学食品科学与工程学院的刘芙蓉、陈海华*等采用自动电位滴定仪、动态流变仪、光学微流变仪、圆二色谱（CD）仪、荧光分光光度计、扫描电子显微镜和紫外-可见分光光度计系统研究蛋白质浓度、热诱导温度（60、85 ℃）和环境pH值（2.0，酸性；4.5，等电点；7.0，中性；9.0，碱性）对WPC分子构象和WPC凝胶微观结构的影响，从微观角度揭示WPC凝胶的形成机制，以期为改善蛋白凝胶性能提供理论参考。

1、pH值对WPC溶液α的影响

如图1所示，pH值的降低使WPC的|α|先减小后增大，pH 4.5时，α＝0。Božič等发现，β-乳球蛋白的净电荷会随环境pH值的变化而变化。Ako等发现电荷斥力在等电点（pI）处最小，改变pH值可使豌豆蛋白和β-乳球蛋白更接近α＝0的等电点。这可能是因为pH值能改变蛋白质构象，进而改变蛋白质的α。由图1可以看出，WPC质量浓度对α的影响与pH值有关。α＜0时，增加WPC质量浓度会使α减小；而α＞0时，WPC质量浓度的增加会使α增加；在α＝0附近，WPC质量浓度对α的影响较小。

2、WPC的溶胶-凝胶状态分析

如图2B所示，热诱导温度为85 ℃时，WPC溶液质量浓度小于30 mg/mL时不能形成凝胶；WPC质量浓度在50～80 mg/mL时，可在pH 4.0～6.0范围内形成均匀凝胶；WPC质量浓度在100～120 mg/mL时，可在pH 2.0～6.0范围内形成均匀凝胶；WPC质量浓度超过130 mg/mL时，则可在pH 2.0～9.0范围内形成均匀凝胶。

由图2B可知，热诱导温度为85 ℃、pH 4.5时（对应α＝0），形成均匀凝胶所需的蛋白质量浓度最低，为40 mg/mL；当pH 5～6时，形成均匀凝胶所需的蛋白质量浓度则增加至50 mg/mL；当pH≥7时，形成均匀凝胶所需的蛋白质量浓度超过120 mg/mL。由此可以看出，WPC易在酸性条件下形成凝胶，且α接近于0时，更容易形成凝胶。

由图2A、B可知，与60 ℃的热诱导温度相比，WPC在85 ℃加热时，可形成均匀凝胶的蛋白质量浓度范围、pH值范围（α范围）更大。Nicolai等也发现在低于70 ℃加热乳清分离蛋白悬浊液时，胶凝效果不理想。这表明较高的热诱导温度能促进蛋白质分子链的展开，增强蛋白质分子间的疏水相互作用和静电吸引力，形成更好的三维凝胶网络。

3、WPC凝胶化的动态流变性质分析

如图3B所示，85 ℃热诱导的凝胶，在初始加热阶段（25～55 ℃），WPC的G′和G″均较低，且G′＜G″；在一定范围内，随着温度的升高，G′和G″没有明显变化；温度升高至55 ℃时，G′明显升高，且G′＞G″，凝胶开始形成，该温度为凝胶温度，所用时间（33 min）即为凝胶时间（表1）。在恒温和降温过程中，G′和G″持续增加，表明降温过程能进一步强化WPC的凝胶网络结构。Xiao Yaqing和Li Quanyang等也发现，乳清蛋白凝胶在冷却过程中G′和G″会显著增加；Pouzot等研究发现球状蛋白达到凝胶温度后，G′迅速增加，冷却过程中又升高了2～3 倍。

对比图3A和3B，热诱导温度不同，WPC溶液的流变曲线略有差异。85 ℃热诱导时，WPC在升温过程中已形成凝胶，而60 ℃热诱导时，到达恒温阶段才形成凝胶。此外，85 ℃热诱导的凝胶，G′可超过70 000 Pa，远高于60 ℃热诱导的G′（50 000 Pa）；85 ℃热诱导凝胶的G″也高于60 ℃，说明85 ℃热诱导的凝胶黏弹性更强。

4、WPC凝胶化的微流变学性质分析

由宏观溶胶-凝胶状态图（图2）和动态流变性质结果可知，WPC质量浓度为150 mg/mL、热诱导温度为85 ℃时，WPC形成凝胶的pH值范围最广。为进一步描述WPC凝胶形成动力学性质，采用不损伤WPC凝胶结构的微流变学方法，探究WPC质量浓度为150 mg/mL、热诱导温度为85 ℃时的凝胶特征。

光学微流变技术通过布朗运动中粒子的运动速度和运动范围反映体系黏度和弹性，具有灵敏度高、受外界干扰小等优点，可以在无损条件下测定凝胶的黏弹特性。粒子的MSD是去相关时间的函数，随着去相关时间的延长，黏性样品的MSD呈线性增长，而弹性样品中的颗粒被限制在网络结构中，MSD呈非线性增长。

图4可反映WPC溶液在升温→恒温→降温过程（图中MSD曲线颜色由蓝色渐变为红色的过程）中逐步形成WPC凝胶的过程。不同pH值条件下的MSD曲线中，WPC粒子首先呈现出斜率较高的蓝色线性曲线，随着加热的进行，曲线斜率逐渐降低，变为绿色曲线，并逐步形成MSD比较稳定的平台区。这表明，开始时WPC粒子可以在溶液中自由移动，MSD曲线呈现为高斜率的直线，即WPC粒子在一段较短的去相关性时间内具有很大的MSD变化，WPC粒子运动剧烈；随着加热的进行，曲线斜率的降低说明WPC粒子间相互作用增强，溶液黏度升高，WPC粒子的运动受限；平台区的出现说明在一段较长的去相关性时间内，WPC粒子保持较小的运动变化，即WPC凝胶已经形成。

如表2所示，不同pH值的WPC溶液加热前的SLB在0.67～0.81之间，呈液态性质，85 ℃加热后，SLB显著降至0.19～0.30之间，类固体行为占主导地位，说明形成了WPC凝胶。pH 2.0、4.5时形成的WPC凝胶，其SLB小于pH 7.0、9.0时凝胶的SLB，说明pH 2.0、4.5时有利于形成弹性更强的WPC凝胶。

5、WPC凝胶的蛋白二级结构分析

如图5所示，pH 7.0时，未加热诱导的WPC凝胶在190 nm波长处有一个正峰，是典型的α-螺旋结构的特征峰；在208～222 nm范围内有较宽的负峰吸收带，表明存在α-螺旋、β-折叠和无规卷曲等蛋白质二级结构。由表3可知，pH 7.0时，未加热诱导的WPC凝胶中α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲等二级结构的相对含量分别为11.3%、44.6%、19.3%和29.5%。

由图5可知，60 ℃加热对WPC凝胶的CD图吸收峰的位置和强度影响较小。但85 ℃加热时吸收峰强度显著降低。由表3可知，pH 7.0时，85 ℃热诱导制备的WPC凝胶的α-螺旋含量由11.3%降至9.2%，无规卷曲含量则由29.5%升高至31.1%。这可能是因为加热会破坏α-螺旋结构中的氢键，导致α-螺旋含量显著降低；热诱导温度超过85 ℃时，蛋白质发生不可逆变性，蛋白质结构迅速展开，无规卷曲结构含量增加。

从图5还可以看出，pH值对WPC凝胶的CD图吸收峰强度的影响较大，190 nm处吸收峰在pH 4.5时强度最小，pH 2.0时强度最大，pH 7.0、9.0时强度相近。由表3可知，当WPC溶液的pH值远离等电点时，α-螺旋含量显著增加，β-折叠含量显著减少。中性pH值条件下85 ℃热诱导的WPC凝胶的α-螺旋含量9.2%，β-折叠含量43.6%，无规卷曲含量31.1%。这些结果表明蛋白质分子的展开和聚集与溶液的pH值有关。因此，热诱导和pH值能引起WPC分子二级结构的展开、重新排列和聚集，影响蛋白质的有序结构（如α-螺旋和β-折叠等）。

6、WPC凝胶的蛋白三级结构分析

如图6所示，环境pH值对WPC内源荧光光谱谱线位置和强度有较大影响。未加热处理的样品，WPC溶液在等电点条件下（pH 4.5）的最大荧光强度波长位置（λ max ）为329 nm，荧光强度最低，发生荧光猝灭现象；远离等电点时，荧光强度明显增强；pH 2.0、9.0时，λ max 明显红移至332 nm。λ max 发生红移表明环境pH值的改变引起WPC构象的变化，使疏水区域的更多色氨酸残基暴露于溶剂中。

由图6可知，加热处理也会引起WPC的λ max 红移，且热诱导温度越高，红移现象越明显，而等电点附近的WPC溶液尤为明显。在pH 4.5时，经60 ℃和85 ℃热诱导后，WPC的λ max 从329 nm分别升高至333 nm和334 nm。

7、WPC凝胶的微观结构分析

如图7A所示，WPC溶液pH值在远离等电点时（pH 2.0、7.0、9.0），WPC凝胶表面光滑，结构细腻，呈半透明状态；但在等电点附近（pH 4.5）时，WPC凝胶表面粗糙、孔洞较多、有明显的颗粒感，为白色不透明凝胶。因此，蛋白质凝胶的网络结构与环境pH值有关。

放大6 000 倍观察WPC凝胶的表面（图7B）可以发现，pH值远离等电点条件下形成的WPC凝胶微观表面光滑，存在细链状聚集体；但在等电点附近，形成的WPC凝胶表面分布有大量尺寸较大的球状颗粒聚集体，颗粒聚集体堆积成多孔、片层状微观表面。

8、WPC分子间相互作用力分析

如图8所示，pH值对WPC凝胶悬浊液透光率有很大影响。pH 4.5时，WPC凝胶悬浊液透光率最低，静置后极易形成肉眼可见的沉淀，说明等电点附近容易形成尺寸较大的聚集体，使WPC凝胶悬浊液浊度升高。pH 2.0、4.5时，热诱导温度对WPC凝胶悬浊液透光率影响不明显，但pH 7.0、9.0时，经85 ℃热诱导的WPC凝胶悬浊液透光率明显低于经60 ℃热诱导，且3 种解离剂的加入并没有改变这种规律。这可能是因为pH 2.0、4.5时，60 ℃和85 ℃均能诱导形成WPC凝胶，但pH 7.0、9.0时，只有85 ℃才能诱导形成WPC凝胶（图2）。

从图8还可以看出，与对照（不添加解离剂）相比，不同的制备条件（温度、pH值）下，加入尿素、SDS和DTT等蛋白解离剂后制备的WPC凝胶，其凝胶悬浊液透光率均明显升高，说明3 种解离剂的加入能破坏维持WPC凝胶稳定的氢键、疏水相互作用、二硫键作用。3 种相互作用的强度与凝胶制备的热诱导温度有关。pH 2.0、85 ℃制备凝胶时，3 种解离剂的加入使凝胶悬浊液透光率分别升高12%、15%和7%，而60 ℃制备时，透光率分别上升16%、18%和9%，即85 ℃热诱导的凝胶具有更强的抗解离效果，说明温度的升高可以明显增强WPC凝胶中的氢键、疏水相互作用、二硫键作用，使凝胶更加稳定。

结论

热诱导温度和pH值都能影响WPC凝胶的形成，但二者的影响机理不同。与60 ℃相比，热诱导温度为85 ℃时，能形成凝胶的WPC溶液质量浓度、pH值范围更大，所得凝胶的G′较高。较高的热诱导温度能促使WPC分子充分展开，降低α-螺旋含量（pH≥4.5），使无规卷曲含量升高，λ max 红移，促进蛋白分子之间碰撞，从而可能使分子间疏水相互作用、氢键与二硫键作用增强，形成致密的网络结构和黏弹性强的WPC凝胶。pH值可能通过改变WPC分子α、蛋白分子二级和三级结构的展开影响凝胶网络结构。在WPC分子等电点（pH 4.5）附近，净电荷减少，分子间静电斥力降低，容易聚集并形成粗糙颗粒状凝胶；远离等电点时，蛋白质分子表面α大，静电斥力强，分子不易聚集，有利于形成细链状结构的凝胶。这为研究乳清蛋白凝胶体系及其在不同环境中的实际应用提供理论基础。

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通信作者简介

陈海华，女，1973年生，中共党员，青岛农业大学巴瑟斯未来农业科技学院副院长，教授，博士，博士生导师。日照市创新领军人才（团队）负责人、“青岛农业大学·佳士博”山东省省级研究生联合培养基地负责人，山东省食品科学与工程类专业教学指导委员会秘书长，山东省产教融合学科（专业）负责人，山东省食品科学技术学会常务理事，青岛市农产品加工与质量安全工程研究中心技术负责人，青岛市食品科学技术学会常务理事，青岛市营养学会常务理事，青岛市节能专家库专家，青岛市食品安全企业标准备案审查专家库专家，山东省一流本科课程“食品化学”负责人，食品化学优秀教学团队负责人。先后主持、参加国家自然科学基金、山东省自然科学基金及横向合作课题20余项。以第一作者或通讯作者在国内外知名刊物上发表学术论文150余篇，其中SCI、EI收录65篇；授权国家发明专利6项；荣获地厅级以上的科技成果奖15项。

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第一作者简介

刘芙蓉，女，1996年生，青岛农业大学食品科学与工程学院粮食、油脂及植物蛋白工程专业硕士研究生。

本文《热诱导温度与pH值对乳清浓缩蛋白凝胶结构和性质的影响》来源于《食品科学》2022年43卷20期125-134页，作者：刘芙蓉，王雨生，李鹏，房子蔚，陈海华。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20211126-332。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

图片来源于文章原文及摄图网。

Food Science of Animal Products（ISSN: 2958-4124, e-ISSN : 2958-3780）是一本国际同行评议、开放获取的期刊，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心主办，中国食品杂志社《食品科学》编辑团队运营，属于食品科学与技术学科，旨在报道动物源食品领域最新研究成果，涉及肉、水产、乳、蛋、动物内脏、食用昆虫等原料，研究内容包括食物原料品质、加工特性，营养成分、活性物质与人类健康的关系，产品风味及感官特性，加工或烹饪中有害物质的控制，产品保鲜、贮藏与包装，微生物及发酵，非法药物残留及食品安全检测，真实性鉴别，细胞培育肉，法规标准等。

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