大脑神经环路的自动化突触级重建技术，畅想未来的连接组绘制

突触连接的密集重建需要整个大脑的高分辨率电子显微镜图像和工具来有效地追踪整个神经元。

为了生成这样的资源，近日，Herwig Baier团队通过电子显微镜对幼年斑马鱼大脑进行了切片和成像，并重建了一个由208个参与视觉运动处理的神经元组成的网络。Nature Method杂志发表了他们最新的研究成果，名为“Automated synapse-level reconstruction of neural circuits in the larval zebrafish brain”。

中枢神经系统中的信息处理是由相互连接的神经元进行的。突触是该网络中通信的关键部位，只能通过电子显微镜 (EM) 识别特定的一对神经元。之前有研究尝试重建有机体的神经系统回路，例如秀丽隐杆线虫，创建的连接图对于研究神经回路至关重要。与此同时，已经为无脊椎动物物种生成了大脑的 EM 重建。到目前为止，还没有为脊椎动物提供具有可比分辨率的全脑数据集。

以突触分辨率将功能与结构联系起来可能涉及记录神经元活动，例如，通过双光子 (2P) 钙成像，然后用体积 EM (vEM) 重建潜在的细胞连接。幼年斑马鱼 (Danio rerio) 特别适合这种方法。在受精后 5 天，幼年斑马鱼大脑的大小与成年果蝇相当：从头端到尾部700 μm，最大宽 450 μm，从背侧到腹侧表面最大 320 μm（图1a，b）。为幼年斑马鱼生成了数千个单神经元形态和区域到区域（中尺度）接线图的全脑目录，这些数据提供了对 vEM 跟踪的合理性检查，尤其是远程预测。

图1.顶骨前2P钙成像和全脑幼虫SBEM数据集采集。

光流神经元及其连通性的追踪

图2显示作者将在功能记录之后拍摄的高分辨率 2P z-stack与 vEM stack坐标（图2a-d）对齐，进一步建立了功能识别的细胞和 vEM 数据集中的细胞之间的对应关系。

他们选择的对应点，从大规模结构（心室和血管）到更精细的结构（例如，个体躯体），确定了重建细胞之间的突触，在这 208 个神经元之间产生了总共 1,079 个突触接触（图2i，j）。

图2.功能特征的顶叶前神经元的映射和EM重建。

最后，作者将 Max Planck Zebrafish Brain Atlas（mapzebrain，http:/mapzebrain.org）注册到他们的 vEM 数据集。mapzebrain地图集提供了参考幼虫大脑（“标准大脑”）中 112 个区域的带注释码。作者根据两个数据集中的体细胞和神经细胞区域的分布进行了映射（图3a，b）。这将 EM 和光学显微镜 (LM) 坐标系带入配准（图3c）。

图3. LM Atlas和vEM stack的注册。

自动分割和人工校对

作者使用 FFN22 首先创建基础分割，最小化合并错误，然后将其聚合以减少分割错误，同时将合并错误保持在可接受的水平（图4a，b）。

生成的单元格或单元格片段既显示在 3D 视图中，也显示在覆盖在原始数据上的切片视图中。在顶盖神经元样本（n = 18）中，每个细胞平均需要 2.8 次和 98.5 次交互（鼠标点击）来校正合并和分裂错误（参见图4c中的分裂说明）。

图4.自动神经突分割。

顶叶SINs的突触伙伴

为了对校对工作流程进行基准测试，作者首先追踪一个神经元，在顶盖的 SIN 中随机选择，以及它的所有突触前和突触后伙伴（SIN1；图5）。SIN 是一类广泛参与处理视觉刺激的顶盖细胞。由此产生的重建揭示了典型的 SIN 形态：在纤维层和灰色表面（SFGS3/4 层，图5a）中有一个广泛的单层树枝状结构。作者沿着 SIN1 的所有分支搜索突触前和突触后位点（图5a）。

总的来说，他们确定了 340 个突触（输入：155，输出：185）。一些 SIN 神经突具有混合的轴突和树突特征，突触前和突触后位点通常非常接近（图5a，b）。从这些位点开始，追踪了所有的突触伙伴（图5c-g）。

接下来，作者追踪了另一个 SIN（SIN2）的所有伙伴细胞（图5f-h 中的橙色）。SIN2 于同一顶盖下层，形态与 SIN1 相似。输入突触来自 RGC (92个)、PVIN (45个)、后脑 (5个)、pretectum (3个) 和其他 SIN (3个，其中 SIN1)。

总之，这项工作提供了一个 SIN 网络及其所有突触伙伴。

图5.重建 SIN 及其合作伙伴。

结 论

本文作者描述了一个数据集，其中包含幼年斑马鱼大脑的 EM 体积，通过自动生成的 121,000 个细胞核图、突触接触位置和神经突的提议分割来增强。该分辨率适用于突触规模的重建。大约0.058 mm3的EM体积由12.5 teravoxels表示（近29,000个切片，每个25 nm厚，以14 × 14 nm2像素大小成像）。作者开发的计算工具可以从这些数据中直接提取数据集中的连接信息。

斑马鱼系统另一个值得追求的方向是发育和成长。虽然目前的数据集包含一个幼年的大脑，但即使是成年斑马鱼的一百倍大的大脑仍然可以进行全脑 EM 重建。作者预计技术进步将使斑马鱼（包括突变体和疾病模型）中生成连接组成为未来的一项常规任务。

https://doi.org/10.1038/s41592-022-01621-0

参考文献：

Svara, F., Förster, D., Kubo, F. et al. Automated synapse-level reconstruction of neural circuits in the larval zebrafish brain. Nat Methods 19, 1357–1366 (2022).

编译作者：Ayden（brainnews创作团队）

校审：Simon（brainnews编辑部）