Chem. Rev.：液相多肽合成：多肽制备的第三波

导读

近日，多肽化学的泰斗级人物Fernando Albericio教授在Chemical Review上发表了一篇：Liquid-phase Peptide Synthesis (LPPS): A Third Wave for the Preparation of Peptides (液相多肽合成：多肽制备的第三波)，对液相多肽合成的现状做了详细的评估，并对其未来发展方向做了高瞻远瞩的预测。液相多肽合成的复兴，不仅摆脱了对有害溶剂DMF(N,N-二甲基甲酰胺), NMP（N-甲基吡咯烷酮）的依赖，而且可以极大地提高多肽合成的生产效率，降低生产成本，必将对多肽制药产业产生深远影响。

正文

液相多肽合成（LPPS）还是固相多肽合成（SPPS）?这是多肽工业化学家在工艺开发前都会问到的问题。这两种合成策略都有着各自天然的优势与劣势。液相多肽合成适合大体量的多肽药物或者多肽化妆品的生产，在生产规模和生产成本上都有明显的优势，但它的工艺开发比较复杂，生产周期较长，需要结晶或者纯化中间体，而这些问题却都是固相合成的优势所在。

所谓的多肽制备第三波，是建立在多肽合成两大传统策略的基础之上而阐述的 (图1)：第一波: Classic solution peptide synthesis (传统液相多肽合成，CSPS)，意指诺贝尔化学奖得主，Bruce Merrifeld教授在上世纪60年代发明固相多肽合成之前，业界人士所采用的液相多肽合成策略。第二波：SPPS (固相多肽合成)。

图1. 上世纪以来多肽化学发展图谱（图片来源：Chem. Rev.）

尽管固相合成方法在目前的工业界大行其道，但其也存在不可逾越的自身缺点，比如需要使用过量的试剂与溶剂。从绿色化学的角度来看，液相合成被重新加以重视。不同于经典的液相多肽合成，如今的液相手段增加了可溶性C-端标签（Tag）策略，类似于树脂，将增长的多肽链固化其上。但因为标签巨大的亲脂性，形成的多肽-标签加合物可以溶于有机溶剂，并且溶解性显著异于试剂和副产物，可以通过简单的沉淀、过滤或萃取得到这些多肽-标签的加合物中间体，从而实现类似于固相合成的洗脱法去除过量试剂和副产品的目的。LPPS可以公斤或吨级规模生产，可以自动化，生产过程中的能量输入低；劳动力少；能源和材料消耗成本低。

近年来，液相多肽合成的C-端标签的发展实现了飞跃，通过全氟烷基、离子液体、聚碳、疏水聚合物和含磷标签，从多分散聚乙二醇 (PEG) 到单分散 PEG。Albericio的这篇综述涵盖了以下范畴：(i) 基于 PEG 的肽合成； (ii) 膜技术支持的肽合成；(iii) 氟技术； (iv) 离子液体 (IL)； (v)聚碳化合物； (vi) 疏水聚合物 (图2)。 每个部分涵盖肽合成的最通用方案，包括肽的规模、产量和纯度。

2.PEG标签LPPS

在 PEG-LPPS 中，PEG 类型的标签在二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)、甲苯、乙腈 (ACN)和水中具有较高的溶解度，但难溶于叔丁基甲基醚(MTBE)，乙醚(DEE)、己烷和异丙醇(IPA)。这种溶解度的差异可以为肽-PEG LPPS技术所利用，通过沉淀或过滤的方法纯化中间体，并可以在肽增长过程中洗涤掉不需要的试剂和副产物。LPPS 的常用PEG标签如图3所示。

图3. LPPS的常用PEG类型标签结构（图片来源：Chem. Rev.）

C-端肽羧酸的PEG 标签包括，PEG14-PEG15 ，类似于 Wang 树脂（使用高浓度TFA 切割），PEG16（trityl 手臂）和 PEG17（二苯甲基手臂），后两者可以使用低浓度的TFA进行切割。 应用于C-端酰胺肽的标签包括，PEG18（Rink amide手臂）和PEG19（BAL 手臂），用高浓度TFA切割。 这些PEG-LPPS标签与以前在SPPS中使用的任何手臂都相吻合。

如同SPPS一样，最先应用于PEG标签LPPS技术的也是Boc/Bzl 化学。本世纪初，适用于Fmoc/tBu的相应技术逐渐流行开来，分子量5000的PEG标签被使用在这一过程中。每一个氨基酸缩合步骤得到的多肽-标签中间品通过乙醚沉淀的方式得到分离。标签切割则通过TFA溶液得以实现。Fmoc 的去保护可以通过TBAF·H2O /1-辛硫醇(捕获试剂)的 DMF 溶液实现，或者使用常规的20% piperidine/DMF溶液处理。中间品在乙醚中沉淀，并使用MTBE、异丙醇和乙醚进行淋洗。氨基酸缩合则由PyBOP或TPTU介导，在HOAt/DIPEA的存在下完成。在TFA切割和整体去保护后，PEG可在硅胶柱上通过固相萃取的方法上分离，使用DCM/DEE 或者 DCM/MeOH做为洗脱液，得到最终的多肽产物。PEG-标签LPPS的技术特点归纳见表1。

表1. 多分散PEG-标签LPPS路线的特征归纳

3. 膜技术LPPS（MEMBRANE-ENHANCED PEPTIDE SYNTHESIS，MEPS)

膜技术多肽合成MEPS本质上是PEG-标签LPPS的一个衍生技术，反应中的试剂通过有机溶剂纳米过滤(OSN)的方法实现与多肽中间产物的分离。有机溶剂纳米过滤依靠压力动力过滤的方式分离溶液中的分子（分子量200-2000 kDa）。过滤膜可以是聚合物 (Vicote PEEK, DuraMem 500, DuraMem 900)，也可以是陶瓷材质 (Inopore 450 或 Inopore 750)。溶质截留和渗透通量两个参数决定了膜的选取。膜功效由截留分子量（MWCO）表征，高于MWCO的溶质分子可以获得超过90%的溶质截留。MEPS路线通常使用分子量2000-8000的PEG作为标签，标签可以是线性结构，也可以是球形结构。支链球形标签可以获得更高的溶质截留。通常来说，MEPS合成策略分为以下几个步骤：1）酰胺聚合反应；2）使用定容渗滤（CVD）的方法洗涤反应液；3）Fmoc去保护；4）再次使用CVD洗涤反应液。图4显示了这四个步骤。目标多肽缩合完毕后，使用切割液进行切割和去保护。

MEPS的两种方案在图4中系统显示。第一种方案执行两次渗滤（一次在氨基酸缩合后，另一次在Fmoc去保护后，图4（1））。第二种方案（PEPSTAR）仅在Fmoc去保护后进行渗滤操作（图4（2））。图5总结了MEPS方案中常用的PEG标签的化学结构。

图4. MEPS多肽合成路线图（I）双渗滤方案；（2）单渗滤方案（PEPSTAR）（图片来源：Chem. Rev.）

图5. MEPS常用可溶性标签（图片来源：Chem. Rev.）

在一项五肽H-Tyr-Ala-Tyr-Ala-Tyr-OH 和 H-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH 的MEPS合成中，MEPS1（4-(羟甲基)苯氧乙酸）被使用做标签。第一个氨基酸与标签的缩合酯化反应通过DIC/HOBt在DMF中完成（15分钟预活化，2小时缩合）。过量的试剂通过10体积的CVD被排除出反应体系。20% piperidine/DMF 30分钟去Fmoc保护基，接下来是12体积的CVD。氨基酸缩合由PyBOP控制并在1小时内完成，紧接着进行渗滤步骤。如此的缩合→CVD→Fmoc去保护→CVD的循环进行多轮反复，直到目标多肽合成完毕。多肽-MEPS1复合物首先在乙醚中沉淀分离，然后使用TFA/苯酚/水（10：0.7：1）进行3小时的切割和去保护。多肽产物再次在乙醚中沉淀分离，并用液相色谱纯化。两个5肽的总体产率均为94%。而在PEPSTAR策略中，执行的是氨基酸缩合 →Fmoc去保护 → CVD的循环。

4.氟标签LPPS

全氟烷基标签可以同时具有亲氟性，亲脂性，和疏水性的特征。这些属性使得氟标签易于从水相或有机相中得到分离，并应用于LPPS。一旦反应进行，这些氟标签(轻含氟物或重含氟物)可以比较容易地通过氟固相萃取（F-SPE）或含氟液-液萃取（FLLE）的方式与其他非氟化合物分离。这种分离的概念展现于图6。常用的氟标签总结在图7中。

图6. 通过A) 轻含氟物的氟固相萃取（F-SPE）和B)重含氟物的含氟液-液萃取（FLLE）的方式实现纯化效果的概念图（图片来源：Chem. Rev.）

FTAG3 被用作促甲状腺素释放激素(pGlu-His-Pro-NH2)的LPPS的氟标签。5% piperidine/FC72-DMF (FC72是全氟己烷，与有机溶剂和水都不互溶)完成Fmoc去保护。反应溶液用柠檬酸水溶液和NaHCO3水溶液洗涤。氨基酸缩合反应使用PyBOP作为缩合试剂，并使用C4F9OEt/DMF作为溶剂。反应结束后，反应体系用MeOH萃取。中间体多肽-标签在FC72相中，并进入下一轮的Fmoc去保护和氨基酸缩合循环。缩合好的多肽被TFA/H2O/1,4-丁二硫醇切割去保护。反应体系分为FC72, 水，和甲苯三相，多肽进入水相，经过液相色谱纯化后得到最终产品， 产率为62%。氟标签进入FC72相，有机试剂则进入甲苯相。

图7. 常用的氟标签化学结构（图片来源：Chem. Rev.）

5. 离子液体标签LPPS

离子液体也可以作为标签在液相多肽合成中使用，该综述列举了图8中的几种常见的离子液体LPPS标签。

图8. 常见的离子液体LPPS标签（图片来源：Chem. Rev.）

6.碳基标签LPPS

长脂肪链的存在可以显著增加多肽-标签的疏水性，而这种高疏水性可以不受多肽链增长影响，因此，以长脂肪链为基质的标签也在LPPS中得到了应用。这些碳基标签可以在诸如乙腈或甲醇的极性溶剂中沉淀，因此为中间品在氨基酸缩合和Fmoc 去保护的分离提取提供了基础，这种过程被成为沉淀/萃取过程（precipitation/extraction）。常用的碳基LPPS标签如图9所示。图10显示了碳基标签LPPS的流程示意。

图9. 常用碳基LPPS标签化学结构（图片来源：Chem. Rev.）

图10. 碳基标签法介导的LPPS示意图。（图片来源：Chem. Rev.）

以PC1为例，苯环上的给电子基团可以增加多肽与标签之间的酸敏感性（稳定酯键酸解后苄基阳离子），而拉电子基团则增加其稳定性。第一个氨基酸缩合到标签的酯化反应由EDC-HOBt-三乙胺（2当量）的DCM溶液实现。反应液在经过盐水萃取后，有机相由MgSO4干燥并在甲醇中沉淀分离。得到的产物溶解于DCM,并加入piperidine脱Fmoc。反应结束后加入甲醇，沉淀H-AA-O-PC1产物。接下来Fmoc-Xaa-OH/EDC/HOBt (1:1.1:1, 2 当量) 的DCM溶液进行氨基酸缩合反应。反应结束后，反应液先经盐水萃取，有机相干燥并在甲醇中沉淀。这样的脱Fmoc/氨基酸缩合的循环一直进行到多肽的缩合完毕。切割和去保护由4 N HCl/乙醇溶液过夜反应完成。溶剂被真空蒸干，残留物经正己烷沉淀后得到目标产物Fmoc-Leu-Phe-Ala-OH。图11展示了碳基标签法LPPS的中间品分离过程。除了DCM之外，THF或者THF/DMF (9:1)也可以作为氨基酸缩合或脱Fmoc的溶剂，而乙腈也常被用作沉淀中间品的反溶剂。对于在合成过程中容易产生分子间聚合，从而引发反应溶液粘稠并降低缩合效率的情况，也可使用环己烷/THF的混合液作为溶剂。在这种情况下，氨基酸缩合和脱Fmoc将在双相条件下进行。遇到中间品形成凝胶而难以沉淀的情况，可以在反应体系中加入矽藻土（diatomite）协助产物沉淀，沉淀物经洗涤后加入非极性溶剂萃取多肽-标签产物，并分离矽藻土。这种策略被研究者命名为“捕获-释放”手段（capture and release）。

图11.碳基标签法LPPS中间品分离示意图。（图片来源：Chem. Rev.）

PC4作为标签通过Fmoc/tBu化学合成了两个长肽bivalirudin(H-D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH) 和h-ghrelin[H-Gly-Ser-Ser(n-octanoyl)-Phe-Leu-Ser-Pro-Glu-His-Gln-Arg-Val-Gln-Gln-Arg-Lys-Glu-Ser-Lys-Lys-Pro-Pro-Ala-Lys-Leu-Gln-Pro-Arg-OH] （bivalirudin和h-ghrelin分别使用了3和4个片段进行最终的液相片段缩合）。HATU/HOAt/THF在这个合成中引导了氨基酸缩合反应, 1% DBU/1% PIP/THF负责脱Fmoc反应。最终分别以64% 和68%的产率得到了bivalirudin 和 h-ghrelin。

Ajinomoto 公司开发的PC11-PC12标签，通过脂肪链的侧链分支，大大增加了标签的疏水性，使得LPPS过程中，中间品的分离摆脱了传统的沉淀手段，而采用两相萃取的方式，含有中间品多肽-标签的相直接进入下一步的反应步骤，从而避免了沉淀，洗涤，重新溶解的步骤，不仅缩短了生产时间，而且显著地降低了溶剂的用量。

Degarelix （10肽，C-端酰胺）和bivarulirudin（20肽，C-端羧酸）分别使用PC11和PC12标签, 通过LPPS手段实现了成功合成。标签-氨基酸偶联反应：PC11: Fmoc−AA-OH−EDC-HOBt (1.1:1.2:1); PC12: Fmoc−AA-OH−EDC-DMAP (1.3:1.4:0.06)，室温下过夜反应，反应溶剂为氯仿。反应液经过20% NaCl萃取。有机相加入硫代苹果酸（作为dibenzofulvene的捕获剂）/DBU (3:8)，室温下2小时脱Fmoc。反应液加入甲磺酸后经NaHCO3水溶液 和 DMF萃取以去除脱Fmoc过程中产生的dibenzofulvene加合物。有机相继续用于下一部分反应而无需浓缩，干燥或者沉淀。氨基酸缩合反应由Fmoc−AA-OH/EDC/HOBt (1.2:1.2:x) (PC11 x=1, PC12 x=0.3)室温下过夜完成。脱Fmoc和氨基酸缩合就按照以上的循环进行，直至目标多肽合成完毕。之后将反应液浓缩，并在乙腈中沉淀目标多肽-标签加合物。切割和去保护反应通过TFA−TIS−H2O (95:2.5:2.5)在室温下2小时完成。Degarelix和bivalirudin分别获得89%/84%的粗品纯度和85%/79%的产率。硅烷基化的标签PC13在LPPS中可以实现更低的粘度和更好的疏水效果，可以被用作合成含义有N-甲基氨基酸的复杂多肽的液相合成。

7.疏水性聚合物

PEG标签通常受困于较低的负载率，而且多肽-PEG加合物在中间品分离过程中时常会与反应试剂产生共沉淀，而无法实现更好的分离副产品的效果。与此同时，PEG标签的溶解度也不令人满意。这种现实催生了聚降冰片烯类标签的诞生。这类标签具有更高的负载率和溶解度，相较PEG更适合LPPS的应用。其结果示意图参见图12。常见的聚合物类LPPS标签如图13所示。

图12.聚降冰片烯类标签结构参考图。（图片来源：Chem. Rev.）

图13.常见的聚合物类LPPS标签（图片来源：Chem. Rev.）

结论与展望

截至目前，上市的多肽类药物已经超过100种，有将近170种多肽类药物在不同的临床阶段，并由400-600种处于前临床期。LPPS所展现的绿色化学的潜质，相比于固相合成来说更有可能成为未来大规模多肽药物合成的有效手段。SPPS的PMI (process mass intensity)大约80-90%来源于溶剂的使用，剩余部分则由过量的试剂和树脂产生。而LPPS在这些领域都具有明显的优势，可以显著地降低由溶剂，过量试剂和树脂所产生的PMI。

PEG标签可以通过有效的超滤或者沉淀引导LPPS的进行，但超滤过程所需的过量溶剂是它无法克服的障碍，所以PEG标签法并未在工业界中实现应用。膜技术LPPS(MEPS)解决了PEG的这个固有问题，可以实现连续性的生产工艺。PEPSTAR技术的PMI目前与SPPS相当，但有望通过优化进一步降低。

氟标签的有效性取决于标签的含氟量，以及与有机溶剂和水都不互溶的全氟溶剂FC72的使用。虽然在分子量较小的多肽上取得成功，但对于大肽来说，氟标签上的氟载量必须增加，以实现较好的中间品分离，但这对于目前的氟标签来说难度较大。除此之外，此工艺涉及的氟化试剂和溶剂成本都较高，对大规模工业生产应用是个致命的影响因素。

离子液体标签法可以通过使用绿色溶剂的手段体现其优势，但它们尚未在工业界中取得广泛应用。

碳基标签可以增加氨基酸的缩合效率以及速率。此项方法目前的最大问题在于需要使用有害溶剂DCM, 氯仿等。Ajiphase工艺实现了通过萃取的手段去除过量试剂，副产品，而无需沉淀中间产物，这样可以大大缩短生产时间并降低溶剂用量。

聚合物标签LPPS是近期涌现出的新选择，它们可以通过自身结构的改性实现更高的负载率和溶解效果。但在工业界尚未涌现出此技术的应用报告。

总结

各种LPPS标签技术的优势及前景展望

文献详情：

Sharma, A.; Kumar, A.; Beatriz G. de la Torre, B. G.; Albericio. F. Liquid-Phase Peptide Synthesis (LPPS): A Third Wave for the Preparation of Peptides. Chem. Rev. 2022, https://doi.org/10.1021/acs.chemrev.2c00132