压力驱动的线粒体转移途径产生所需遗传组合和命运的哺乳动物细胞

CELL REP:压力驱动的线粒体转移途径产生所需遗传组合和命运的哺乳动物细胞

产生具有所需线粒体DNA（mtDNA）序列的哺乳动物细胞有助于研究线粒体、疾病建模和潜在的再生疗法。美国研究人员Alexander N. Patananan等开发了一种高通量线粒体转移装置——MitoPunch，通过将小鼠或人类细胞分离出的线粒体转移到原代或永生的mtDNA缺陷（ρ0）细胞中，产生具有特定mtDNA-nDNA （核DNA）组合的细胞。稳定的分离线粒体受体（stable isolated mitochondrial recipient, SIMR）细胞经限制性培养基分离，能够永久保留供体mtDNA并重新获得呼吸作用。然而，尽管在限制性培养基中生长，SIMR成纤维细胞仍保持ρ0样细胞代谢组和转录组。研究人员将非永生的SIMR成纤维细胞重新编程为诱导多能干细胞（iPSC），随后分化为多种功能细胞类型，包括间充质干细胞（MSC）、脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞。重编程和分化后，SIMR成纤维细胞在分子和表型上与对照成纤维细胞类似。因此，使用MitoPunch能够生产具有独特mtDNA-nDNA组合的SIMR细胞，可用于多种细胞类型的研究和应用。文章以“Pressure-Driven Mitochondrial Transfer Pipeline Generates Mammalian Cellsof Desired Genetic Combinations and Fates”为题发表于Cell Reports。

介绍

哺乳动物线粒体是细胞的动力工厂，在细胞凋亡、活性氧（ROS）和Fe-S簇生成、Ca2+调节、代谢物产生方面有辅助作用。每个线粒体含超过1,100个由细胞核编码并导入的蛋白质，其中大量拷贝为圆形约16.5 kbp的线粒体基因组（mtDNA），编码13种电子传递链（ETC）和呼吸所需的蛋白质。多达1:5,000的人存在mtDNA突变，这种突变会损害高能量需求组织并引发衰竭性疾病，包括癌症、糖尿病和代谢综合征。此外，细胞可能包含不同mtDNA序列的混合物，这种情况被称为异源性（heteroplasmy），多达1/8的无症状个体携带未知的致病性mtDNA突变。因此可控操纵mtDNA序列可以实现对线粒体的研究，并有可能开发mtDNA病的疾病模型或疗法。

在人类生殖领域已有几种线粒体替换策略，可将受精卵中的致病mtDNA与健康供体卵母细胞中的无害mtDNA交换。这些方法有望防止mtDNA异常从携带者母亲传染给其子女。然而体外改变体细胞和组织内mtDNA序列的方法仍存在一定限制。细胞融合产生的“胞质杂合体（cybrids）”能够永久保留供体线粒体。此外导入线粒体的核酸内切酶可以通过靶向特定序列进行破坏，从而改变异质比率来改变线粒体和细胞功能。但这些核酸内切酶生产过于费力、局限于某些mtDNA序列、效率低，并且产物不同质。使用细菌胞苷脱氨酶（DddA）可编辑mtDNA单碱基序列，但效率低且脱靶率令其不尽如人意。

目前有几种方法可将分离的线粒体转移到mtDNA缺陷细胞[称为ρ0 (rho null)细胞]中，以恢复呼吸作用。此外还有研究报道了哺乳动物细胞对线粒体的内吞作用。然而这些研究的重点并不是挽救ρ0细胞及产生能够永久保留供体mtDNA的，稳定的分离线粒体受体（stable isolated mitochondrial recipient, SIMR）克隆。有研究通过将高浓度的分离的供体HEK293T线粒体与ρ0骨肉瘤细胞共培养，产生了数量有限的SIMR克隆。类似的还有细胞能够内吞外源线粒体，甚至在有限的时间内（约1周）改变代谢功能，但这些外源mtDNAs会随时间的推移而丢失。光热纳米叶片可解决这个问题，稳定地将少量分离的线粒体转移到ρ0骨肉瘤细胞中。但纳米刀片费时费力且产量低，三个SIMR克隆中有两个改变了ρ0细胞代谢组。因此需要能够产生大量非转化的稳定克隆的新技术，以通过重编程产生多能性并分化为多种细胞类型来研究不同mtDNA-nDNA（核DNA）组合。

本文描述了一种简单易用的线粒体转移技术，称为“MitoPunch”，以快速生成大量未转化的SIMR克隆。应用MitoPunch进行了一套“流水线”试验，证明了供体mtDNA在不同细胞命运下的受体宿主原代细胞中具有功能。借由本研究建立的方法，利用非永生化材料产生了原代SIMR细胞。还以确定的mtDNA-nDNA组合测量了SIMR细胞的代谢组学、转录组学和生物物理性质状态，对将来产生具有所需的mtDNA-nDNA组合的体细胞的研究具有指导作用。

结果

01-MitoPunch产生不同细胞类型和mtDNA的SIMR细胞

MitoPunch是一个基于光热纳米刀片和生物光子激光辅助细胞手术工具（biophotonic laser-assisted cell surgery tool, BLAST）技术的大规模并行、压力驱动的大型转运平台。MitoPunch使用机械柱塞使柔韧的聚二甲基硅氧烷（PDMS）储器发生物理变形，储器中含1×PBS（pH 7.4）分离的线粒体悬浮液（图1A）。柱塞驱动推动PDMS输送室中的悬浮物通过多孔膜，多孔膜包含许多直径3μm的孔，生长有一层粘附细胞。这种作用直接迫使分离的线粒体进入受体细胞的胞质溶胶。

为证实MitoPunch能够产生SIMR细胞，将分离自约1.5 × 107个HEK293T细胞的线粒体转移至约2 × 105个143BTK-ρ0骨肉瘤细胞中。转移后使用尿苷缺乏培养基选择并分离能够永久保留供体mtDNA的SIMR克隆。由于呼吸缺陷型ρ0细胞具有无活性的二氢硼酸脱氢酶，并且依赖外源尿苷或恢复呼吸来进行嘧啶生物合成，因此这种筛选是可行的。对比同数量线粒体与细胞的共孵育实验，只有MitoPunch产生的带有HEK293T线粒体的143BTK-ρ0细胞（143BTK-ρ0+HEK293T）永久保留了供体mtDNA，并在尿苷缺乏的培养基选择中存活（图1B）。在一组有代表性的线粒体转移实验中，MitoPunch产生了约75个独立的结晶紫染色的SIMR克隆，相比之下共孵育没有获得克隆（图1B）。

接下来研究MitoPunch否能产生带有明确mtDNA-nDNA对（能够传递线粒体疾病特征）的SIMR克隆。线粒体分别来自含A3243G mtDNA替代物的胞质杂合体，该突变常与线粒体脑病、乳酸性酸中毒和卒中样发作（MELAS）相关，以及同一个体野生型（WT）细胞。已知A3243G点突变位于tRNALEU基因，会导致ETC复合物的产生和组装发生改变，使氧化磷酸化受损。MitoPunch将线粒体导入143BTK-ρ0受体细胞并选择培养2周后，获得数十个永久保留MELAS（143BTK-ρ0+MELAS）或WT（143BTK-ρ0+WT） mtNDA的独立SIMR克隆，用Seahorse Extracellular Flux Analyzer测试其中2个克隆的耗氧率（OCR）。结果显示与患者匹配的143BTK-ρ0+WT和天然143BTK对照细胞相比，143BTK-ρ0+MELAS克隆的基础呼吸、最大呼吸和备用呼吸能力显著受损（图1C ），表明MELAS表型的主要代谢缺陷已通过稳定的mtDNA转移实现。

扩大线粒体供体和受体细胞配对范围，以证明MitoPunch的多功能性。从C57BL/6小鼠组织中分离线粒体，MitoPunch将其转移到C3H/An衍生的L929 ρ0永生化成纤维细胞中。选择两周后每个线粒体来源产生了几十个SIMR克隆。相较于接受了低能量需求的脾或肾源线粒体的SIMR克隆来讲，接受高能量需求的心脏、肺或肌肉源线粒体产生的SIMR克隆显示出最强健的呼吸特征（图1D）。还评估了用MitoPunch将异质mtDNA混合物导入细胞。选择有mtDNA突变的小鼠胞质杂合体系分离线粒体，分别为细胞色素B（mt-Cytb）、NADH脱氢酶亚基4（mt-nd4）和NADH脱氢酶亚基6（mt-nd6）基因突变，使用MitoPunch将线粒体单独或与蛋白1:1比例转移到L929 ρ0成纤维细胞中。具有单一突变mtDNA源的SIMR细胞继续表现出严重的呼吸损伤（图1E）。而含有非重叠突变线粒体基因的SIMR细胞显示出明显改善的呼吸特征，有力表明两种线粒体基因都得到稳定保留（图1E）。因此MitoPunch和细胞筛选可作为一种通用方法，来产生具有所需mtDNA-nDNA对的人或小鼠SIMR细胞。将多种类型的mtDNA共转移到同一受体细胞中，也可作为检测突变mtDNA混合物的互补的一种简单方法。

图1MitoPunch是一种多功能线粒体转移技术。（A）MitoPunch线粒体转移平台示意图。（B）共孵育或MitoPunch传递，1×PBS（pH7.4）（对照）或HEK293T细胞线粒体，转移到143BTK-ρ0骨肉瘤细胞中，去尿苷培养基筛选后的结晶紫染色SIMR克隆。数据为3次技术重复的均值±SD。（C）Seahorse XF96 Extracellular Flux Analyzer 测量的OCR，分别为约1.5×104的143BTK-、143BTK-ρ0、WT cybrid、MELAS cybrid, 143BTK-ρ0+MELAS SIMR、143BTK-ρ0+WTSIMR。数据为4次技术重复的均值±SD。

02-MitoPunch产生非转化的非恶性SIMR细胞

为使用非永生化受体细胞获得含mtDNA-nDNA组合的SIMR细胞，建立了一套人成纤维细胞线粒体受体传递方法。用2’,3’-dideoxycytidine (ddC)处理Hayflick-limited BJ包皮（BJ）成纤维细胞、新生皮肤成纤维细胞（NDFs）和成人皮肤成纤维细胞（ADFs）3周，以耗尽内源性mtDNA。原代ρ0人成纤维细胞分别用qPCR和Seahorse assay检测不到mtDNA（图S1A和S1B）和细胞呼吸（图S1C和S1D）。由于ddC可能导致nDNA改变，通过全基因组测序检查了BJ ρ0成纤维细胞，发现只有少数非同义突变，平均每兆碱基0.6个突变，没有染色体断裂，DNA拷贝数也没有变化（表S1）。

将从人外周血单核细胞（PBMC1）分离的线粒体转移到新鲜ρ0成纤维细胞中，随后尿苷缺乏的半乳糖培养基选择。从5-10个BJ成纤维细胞、NDFs或ADFs中，分离出ρ0+PBMC1 SIMR克隆，克隆显示了正确的mtDNA-nDNA序列对和人白细胞抗原（HLA）受体细胞单倍型（图2A–2C）。独立的PBMC2和HEK293T细胞线粒体转移也获得了原代、非永生的SIMR克隆。观察到HEK293T细胞和PBMC2线粒体转移的效率多变，ADFs ρ0+PBMC2没有产生克隆（图S1E）。对含23个BJ ρ0+HEK293T SIMR克隆的大量培养物的分析证实了mtDNA-nDNA对以及HLA单倍型正确（图S1F和S1G）。

通过Seahorse assay检测BJ ρ0+PBMC1和BJ ρ0+HEK293TSIMR成纤维细胞的呼吸功能，结果显示与BJ ρ0成纤维细胞相比，两种SIMR细胞类型的基础和最大呼吸以及备用呼吸能力均有统计学改善，尽管仍低于对照BJ成纤维细胞的水平（图2D和S1H）。免疫荧光（IF）显微显示，BJ ρ0成纤维细胞具有片段化的线粒体网络形态，缺乏含mtDNA的线粒体类核，如之前对ρ0细胞观察到的那样（图2E）。相比之下天然的BJ成纤维细胞显示出网状线粒体网络，每个细胞有几十个线粒体类核（图2E）。根据IF类核斑点数，BJ ρ0+PBMC1和BJ ρ0+HEK293T SIMR细胞似乎都将mtDNA含量恢复到相当于或超过天然BJ成纤维细胞的水平（图2E和S1I）。SIMR细胞线粒体显示出类似于天然BJ成纤维细胞的网状线粒体网络形态，尽管具有更密集和更肿胀的线粒体（图2E和S1I）。尽管SIMR成纤维细胞永久地保留了供体mtDNA，OCR和IF显示转移的mtDNA的同化作用导致细胞特征处于BJ ρ0和天然BJ成纤维细胞之间。

图2SIMR成纤维细胞的产生。（A）从ρ0原代人成纤维产生SIMR细胞的选择流程（天），以及SIMR克隆生产效率数据。从约3×107个PBMC1分离的线粒体经MitoPunch转移到BJ ρ0、NDF ρ0或ADF ρ0受体成纤维细胞中。选择培养后，SIMR克隆用结晶紫染色并计数。（B）BJ、PBMC1、BJ ρ0+PBMC1 SIMR成纤维细胞的D-loop高变区mtDNA序列。箭头表示单核苷酸多态性。（C）用OptiType v.1.3.1算法获得的天然BJ、BJ ρ0、BJ ρ0+PBMC1 SIMR成纤维细胞的主要组织相容性复合体HLA A、B、C的基因座基因分型。（D）Seahorse XF96 Extracellular Flux Analyzer测量的约1.5×104数量的天然BJ、BJ ρ0、BJ ρ0+PBMC1 SIMR成纤维细胞的OCR。数据为4次技术重复的均值±SD。unpaired, two-tailed Student’s t test测量显著性。（E）天然BJ、BJ ρ0、BJ ρ0+PBMC1 SIMR成纤维细胞免疫染色代表图像，双链DNA（dsDNA）（绿色）、TOM20（红色）、共定位（黄色）。图像（100×）由Leica SP8共聚焦显微镜获得，比例尺15μm。也可见图S1和表S1。

03-SIMR成纤维细胞是可重编程的

用OCT4、SOX2、KLF4、cMYC、NANOG和LIN28 RNAs使BJ ρ0+PBMC1和BJ ρ0+HEK293TSIMR成纤维细胞以及天然BJ成纤维细胞重编程，并对TRA-1-60+染色克隆定量。两个独立实验中，天然BJ成纤维细胞平产生136个重编程的TRA-160+克隆（0.068%），而BJ ρ0+PBMC1和BJ ρ0+HEK293T细胞分别产生21个（0.011%）和3个（0.0015%）克隆（图3A和S1J）。检测了BJ ρ0+PBMC1-iPSCs （1、2和11）和BJ ρ0+HEK293T-iPSCs （1、2和4）的三个重编程克隆的多能性生物标记物，并通过流式细胞术检测OCT3/4和SOX2转录因子染色阳性，BJ诱导的iPSC对照也是如此（图3B和S1K）。相反在所有重编程的BJ ρ0+PBMC1-iPSC、BJ ρ0+HEK293T-iPSC和对照BJ-iPSC克隆中，分化细胞生物标志物CD44均为阴性，仅在天然BJ成纤维细胞中免疫染色（图3B和S1K）。IF检测BJ-iPSC和所有SIMR-iPSC重编程克隆也是SSEA-4+和OCT4+（图3C和S1L）。Seahorse分析BJ ρ0+PBMC1-iPSC和BJ ρ0+HEK293T-iPSC克隆显示，在基础呼吸、最大呼吸和备用呼吸能力上，与天然BJ-iPSC的统计差异最小或没有（图3D和S1M）。因此SIMR成纤维细胞重编程产生了带有供体mtDNA的iPSCs。

图3SIMR成纤维细胞可被重编程。（A）用显微镜计数的TRA-1-60+的iPSCs克隆，由天然BJ和SIMR成纤维细胞重编程获得。数据为生物重复平均值。BJ成纤维细胞对照的数据为图S3A中同一数据。（B）流式细胞术测定多能性生物标志物SOX2和OCT3/4，以及成纤维细胞生物标志物CD44。免疫染色样品以彩色显示，同型阴性对照以灰色显示。所示为天然BJ成纤维细胞和BJ-iPSC以及BJ ρ0+PBMC1-iPSC细胞数据。天然BJ成纤维细胞和BJ-iPSCs的数据与图S3B相同。（C）天然BJ成纤维细胞（阴性对照）、BJ-iPSC（阳性对照）和三个BJ ρ0+PBMC1-iPSC克隆的代表性相差图像及IF显微图像，对多能性生物标志物SSEA-4和OCT4进行免疫染色。比例尺100μm。（D）约1.5×104个天然BJ-iPSCs和BJ ρ0+PBMC1-iPSC克隆1、2和11的OCR测量值。BJ-iPSC对照的数据与图S3D相同。数据为4次技术重复的均值±SD。unpaired, two-tailed Student’s t test计算显著性。另见图S1和表S2。

有研究表明致病性mtDNA突变个体的成纤维细胞发生了iPSC重编程，但还没尝试用于含供体的、非天然突变mtDNA的SIMR成纤维细胞。因此研究人员分离了含A3243G MELAS mtDNA突变或WT mtDNA的线粒体，由MitoPunch转移到BJ ρ0成纤维细胞中并选择。BJ ρ0+MELAS SIMR成纤维细胞在重编程过程中表现出增殖缺陷，并且不产生iPSCs（数据未显示）。因此改用NDF ρ0受体成纤维细胞，使用MELAS（NDF ρ0+MELAS）、WT（NDF ρ0+WT）或NDF（NDF ρ0+NDF）线粒体产生SIMR成纤维细胞。Seahorse分析显示，与天然NDF、NDF ρ0+NDF和NDF ρ0+WT相比，NDF ρ0+MELAS成纤维细胞的基础呼吸、最大呼吸和备用呼吸能力显著降低（图S1N）。限制性片段长度多态性（RFLP）PCR分析证实产生了同质NDF ρ0+MELAS SIMR成纤维细胞（图S1O）。RFLP分析还证实产生了约25%-50%的异质NDF ρ0+MELAS/WT成纤维细胞（图S1O）。同质NDF ρ0+MELAS成纤维细胞用前文RNA方法进行同样的重编程，但所有发育中的iPSC克隆都发生了自发分化（图S1P）。NDF ρ0+MELAS/WT异质成纤维细胞的重编程（图S1O）产生20个iPSC克隆，但RFLP分析发现所有克隆仅保留了WT mtDNA（图S1P和S1Q）。为检验重编程方法是否影响突变型mtDNA SIMR-iPSC的产生，用整合DNA、慢病毒和仙台病毒重编程NDF ρ0+MELAS成纤维细胞。在所有情况下，尽管有重编程的早期迹象，NDF ρ0+MELAS细胞还是自发分化（表S2）。此外在补充尿苷、抗氧化剂N-acetylcysteine [Rho相关蛋白激酶（ROCK）抑制剂]或低氧张力进行重编程时，均未获得NDF ρ0+MELAS-iPSCs（数据未显示）。另外4种包含额外mtNDA突变的NDF ρ0 SIMR成纤维细胞重编程策略也获得了类似的结果，突变包括细胞色素B缺失、Kearns-Sayre常见缺失、A8344G或T8993G mtDNA替换（表S2）。因此SIMR成纤维细胞容易保持大量的mtDNA序列，与SIMR-iPSCs相反，后者只能用无害的mtDNA序列产生。需要进一步的生化研究来确定mtDNA序列如何决定SIMR重编程。

04-SIMR-iPSCs产生功能性的、分化的细胞类型

接下来确定了具有等基因核和非天然供体mtDNA的SIMR-iPSCs能否分化。鉴于间充质干细胞（MSCs）在治疗及多项临床试验中的应用潜力，选择其作分化研究对象。BJ-iPSC对照、BJ ρ0+PBMC1-iPSC和BJ ρ0+HEK293T-iPSC被分化为MSC，并用针对表面生物标志物的抗体组进行验证。流式细胞术验证了BJ BJ-MSC对照、BJ ρ0+PBMC1-MSC克隆和BJ ρ0+HEK293T-MSC克隆中，MSC生物标志物CD73、CD90和CD105呈阳性，非MSC生物标志物cocktail呈阴性，包括CD11b、CD19、CD34、CD45和HLA-DR（图4A和S1R）。BJ-MSCs和来自两个mtDNA供体的所有SIMR-MSC克隆都可粘附在塑料上，符合ISCT的MSCs标准（图4B和S1S）。

Seahorse分析BJ-MSC对照、BJρ0+PBMC1-MSC克隆和BJ ρ0+HEK293T-MSC克隆显示，基础呼吸、最大呼吸和备用呼吸能力没有差异或略有差异，表明ρ0成纤维细胞在MitoPunch及重编程和分化后，呼吸变化并不稳定（图4C和S1T）。定量相位显微（QPM）检查SIMR MSCs的关键细胞生物物理特性，发现BJ-MSC对照、BJ ρ0+PBMC1-MSC克隆和BJ ρ0+HEK 293T-MSC克隆的细胞生长率、面积和生物量差异极小或无差异（图4D和S1U）。通过标准免疫抑制试验（可检测MSC临床免疫调节性能），与人PBMC分离的T细胞共培养，比较SIMR-MSC克隆和BJ-MSC对照的功能。发现所有BJ ρ0+PBMC1-MSC和BJ ρ0+HEK293T-MSC克隆都抑制T细胞增殖（图4E和S1V）。BJ ρ0+PBMC1-MSC克隆11显示出最大的免疫抑制和T细胞增殖的减少，而其余SIMR-MSC克隆和BJ-MSC对照间没有检测到大的差异。最后对SIMR-SMR进行定向三向分化：脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞，以证明MitoPunch工程细胞系的临床潜力。结果BJ-MSC对照、BJ ρ0+PBMC1-MSCs和BJ ρ0+HEK293T-MSCs都形成了这三种MSC分化谱系（图4F和S1W）。BJ对照组和SIMR克隆组的脂肪细胞和软骨细胞在表型上相似，而SIMR成骨细胞倾向于产生更多的钙沉积。因此本文的线粒体转移策略通过稳定掺入特定的、无害的、非天然的供体mtDNAs，能够由ρ0成纤维细胞产生iPSCs、MSCs和进一步分化的细胞类型。

图4SIMR iPSCs产生具有三细分化潜力的MSCs。（A）流式细胞检测MSC生物标志物CD73、CD90和CD105，以及非MSCs生物标志物cocktail。有颜色为免疫染色样品，同型阴性对照用灰色表示。BJ-MSC对照的数据与图S5A数据相同。图示为天然BJ-MSCs和BJ ρ0+PBMC1-MSCs代表性克隆。（B）明视野显微镜显示未处理的BJ-MSC和BJ ρ0+PBMC1-MSC克隆1、2和11黏附到塑料上，20×放大（比例尺100μm）。BJ-MSC对照数据与图S5B数据相同。（C）约1.5×104天然BJ-MSCs和BJ ρ0+PBMC1-MSC克隆1、2和11的OCR测量值。BJ-MSC对照数据与图S5C相同。数据为3次技术重复的均值±SD。unpaired, two-tailed Student’s t test检验显著性。（D）天然BJ-MSCs以及BJ ρ0+PBMC1-MSC克隆1、2、11的1:1:1混合的定量相位显微。BJ-MSC对照数据与图S5D相同。图为带有异常值的箱线图。数据分别为77天然BJ-MSCs和172 BJ ρ0+PBMC1-MSCs的均值。Welch’s t test检测显著性。（E）分别以T细胞：MSC = 1:2、1:1、5:1和10:1的比例，将T细胞加入到天然BJ-MSC或BJ ρ0+PBMC1-MSC克隆1、2或11培养物中。共培养5天后，流式细胞术和CFSE染料稀释法测定T细胞增殖。“NS”(无刺激)标记表示没有CD3/CD28珠激活的T细胞。“-ve”(阴性)标记表示刺激的T细胞中没有添加MSCs。“+ve”(阳性)标记表示骨髓源性抑制细胞与T细胞的比例为1:1。数据为3次技术重复的平均值。（F）天然BJ-MSCs和BJ ρ0+PBMC1-MSC克隆1、2和11的三细分化。切片固定并分别用1 μM Bodipy 493/503、1%茜素红S和0.1%番红O染色。所示为脂肪细胞(第一行，20×；比例尺100μm)，骨细胞(第二行，20×；比例尺200μm)和软骨细胞(第四行，5×；比例尺500μm)。另见图S1。

05-SIMR细胞代谢及RNA转录物随细胞命运转变而改变

使用超高效液相色谱-质谱（UPHLC-MS）对154种稳态代谢物进行定量，试验细胞包括成纤维细胞、iPSC和MSC命运的天然BJ、BJ ρ0、BJ ρ0+PBMC1克隆和BJ ρ0+HEK293T克隆。层次聚类显示了独立于线粒体转移状态的成纤维细胞、iPSCs和MSCs的不同分组特征（图S2A和S2B表S3）。代谢物数据的主成分分析（PCA）也显示了代表成纤维细胞、iPSC和MSC命运的三个主要簇，但每个命运中SIMR和天然对照细胞间没有明显差异（图S2C和S2D）。BJ ρ0+PBMC1-iPSC和BJ ρ0+PBMC1-MSC克隆的代谢物组变异分析（MSVA）和欧几里德距离分析显示，它们自身与各自的BJ-iPSC和BJ-MSC对照具有相似的代谢物途径情况（图S2A、S2E和S2F）。相比之下，BJ ρ0+HEK293T-iPSC克隆1和2与克隆4和BJ-iPSC对照有几个代谢途径有区别，特别是嘌呤、嘧啶、谷胱甘肽和乙醇代谢（图S2B、S2E和S2F）。在进一步分化为BJ ρ0+HEK293T-MSC克隆后，BJ ρ0+HEK293T-iPSC克隆中的这种差异不再存在（图S2B、S2E和S2F）。总之，稳态代谢物分析显示，SIMR细胞与天然对照细胞相当，仅有的少数差异在iPSC重编程并向MSCs分化时可以得到解决。

利用RNA测序（RNA-Seq）评估成纤维细胞、iPSC和MSC命运的SIMR细胞中的全转录组。DESeq2用于识别显著差异表达的基因（DEGs），定义为改变倍数曲log2大于0.5，校正后p < 0.05的基因。对于BJ ρ0+PBMC1和BJ ρ0+HEK293T SIMR细胞，与天然BJ对照细胞相比，成纤维细胞命运时有最大数量的DEGs，校正后p < 0.05（图5A和S3A）。将成纤维细胞、iPSC和MSC命运的BJ ρ0+PBMC1细胞分别与天然BJ亲代细胞进行比较，RNA-seq分别识别出1741、194和224个升高的，1827、68和115个抑制的DEGs（图5A；表S4）。对独立产生的BJ ρ0+HEK293T细胞进行转录组分析，成纤维细胞、iPSC和MSC命运中与天然BJ亲代细胞相比，分别有1,377、537和239升高，1,564、648和210抑制的DEGs（图S3A表S4）。

DEGs的反应途径富集分析显示，与天然BJ成纤维细胞相比，SIMR成纤维细胞转录谱中的不同途径发生了改变，包括与细胞外基质组织和补体级联相关的途径（图S3B表S5）。将所有SIMR-iPSC和SIMR-MSCs分别与天然BJ-iPSC和BJ-MSC对照比较，进行差异表达和途径富集分析，确定的DEGs数量显著较少，过多的途径主要由组蛋白转录物簇驱动（图S3C和S3D表S5）。

进一步详细的转录组分析揭示了基于细胞状况和命运的代谢途径差异。体细胞重编程为iPSCs需要代谢转变，从主要氧化磷酸化转为主要糖酵解，对应所有基因组变异分析（GSVA）显示糖酵解相关转录物表达增加的BJ ρ0+PBMC1-iPSC和BJ ρ0+HEK 293 IPSc克隆（图S4A和S4B）。此外GSVA显示，在BJ ρ0、BJ ρ0+PBMC1和BJ ρ0+HEK293T SIMR成纤维细胞中，ETC转录物的表达较天然BJ成纤维细胞中多（图S4A和S4B）。然而免疫印迹显示，琥珀酸脱氢酶（SDHB；复合体II）、泛醇-细胞色素c还原酶核心蛋白2（UUQCRC2；复合物Ⅲ）、细胞色素氧化酶Ⅱ（MT-COXII；复合体Ⅳ），和ATP合酶F1亚单位α（ATP5A；复合物V）结果相反，SIMR成纤维细胞中的ETC蛋白较天然BJ成纤维细胞对照减少（图S4C）。总的来说，全转录组数据分析显示，SIMR克隆和天然对照细胞在成纤维细胞命运上最初的巨大差异在重编程和分化过程中逐渐消失。

检测了MitoCarta2.0数据库中列出的1,158个核基因的RNA转录水平，这些基因编码的蛋白定位于线粒体。对来自这些基因的转录物的分级聚类分析可在成纤维命运时将BJ ρ0+PBMC1、BJ ρ0+HEK293T和BJ ρ0转录物与天然BJ转录物分离出来（图5B和S3B）。两组间DEGs的途径分析显示，天然BJ成纤维细胞中编码ETC蛋白的基因富集（表S4）。值得注意的是，iPSC和MSC命运下没有观察到这种差异聚类（图5B和S5A）。

进一步对mtDNA编码的转录物检查发现，与来自SIMR和天然成纤维细胞的转录物相比，BJ ρ0细胞中所有13种编码基因转录物的表达显著降低，类似（图5C和S5B）。此外与天然BJ成纤维细胞相比，BJ ρ0+PBMC1和BJ ρ0+HEK293T成纤维细胞13种mtDNA编码基因的表达均显著降低（图5C和S5B）。相比之下，在将SIMR和对照成纤维细胞重编程为iPSCs，然后分化为MSCs后，在mtDNA转录水平上没有观察到显著差异（图5C和S2B）。

然后使用MitoXplorer管道量化已识别的DEGs中38个不同线粒体过程的表示。正如呼吸作用消失所预期的那样，与天然BJ成纤维细胞相比，BJ ρ0成纤维细胞中展示出29个线粒体过程DEGs，特别是氧化磷酸化、线粒体基因组翻译和氨基酸代谢过程中（图5D）。类似地，与天然BJ成纤维细胞相比，BJ ρ0+PBMC1和BJ ρ0+HEK293T成纤维细胞分别在30和29个线粒体过程中改变了基因表达谱（图5D和S1C）。使用MitoXplorer的进一步分析突出了两个SIMR系之间的差异，因为与BJ ρ0+HEK293T成纤维细胞相比，BJ ρ0+PBMC1在mtDNA相关氧化磷酸化和线粒体基因组翻译方面的DEGs更少。此外与天然BJ成纤维细胞相比，两种SIMR成纤维细胞系中，与细胞核编码的线粒体翻译和钙信号传递相关的DEGs都比BJ ρ0系更多。值得注意的是，通过重编程，受影响的线粒体过程的数量显著减少，在BJ ρ0+PBMC1-iPSCs和BJ ρ0+HEK293T-iPSCs中分别只有7个和16个过程显示DEG（图5D和S1C）。最后，BJ ρ0+PBMC1-MSCs和BJ ρ0+HEK293T-MSCs分别只显示出3和8个带有DEGs的线粒体过程，在两个SIMR-MSCs系和MSCs对照之间只有ROS防御类似地改变（图5D和S1C）。这些数据揭示了在其他线粒体过程中，成纤维细胞命运中翻译的转录组改变，作为外源性mtDNA功能在SIMR细胞中的潜在差异标记。综上所述，尽管重编程及分化后，SIMR细胞线粒体功能变得与BJ对照组更加相似，但基于转移的mtDNA序列的差异仍然存在。

图5SIMR和天然mtDNA细胞的转录组特征。（A）BJ ρ0+PBMC1细胞与天然BJ细胞在成纤维细胞、iPSC和MSC命运时的DEGs数目比较。（B）核编码MitoCarta2.0数据库基因的层次聚类，分别来自成纤维细胞、iPSC和MSC命运的天然BJ、BJ ρ0和BJ ρ0+PBMC1细胞。（C）标准化、批量校正后的read计数箱线图，分别为成纤维细胞、iPSC和MSC命运的天然BJ、BJ ρ0和BJ ρ0+PBMC1细胞中，13个MitoCarta2.0注释的mtDNA编码基因。Welch’s t test检验显著性。（D）MitoXplorer归类后的DEGs，为BJ ρ0+PBMC1分别与成纤维细胞、iPSC和MSC名运的天然BJ细胞相比，分为38个线粒体过程。另参见图S2、S3、S4、S5以及表S3、S4和S5。

本研究使用MitoPunch开发了一种快速、通用的线粒体传递方法，可产生具有特定mtDNA-nDNA组合的转化或非永生细胞，相对于cybrid技术有很大优势，cybird无法可控选择生理线粒体，或筛选具有所需mtDNA突变的细胞较为耗时。本研究表明，SIMR成纤维细胞的转录组和代谢组与ρ0受体细胞类似，并且重编程为多能性及随后的分化可将其重置为非常类似于未处理的对照细胞。使用其他线粒体转移方法，如不能重新编程的永生细胞系，将无法或很难实现本研究。虽然通过纳米刀片和显微注射也可以产生SIMR细胞，但这些低通量也存在局限性。相比之下MitoPunch能够在2周内产生大量含期望的、稳定的mtDNA-nDNA组合的克隆。

制备用于ρ0受体成纤维细胞研究的SIMR克隆已实现。一些mtDNA-nDNA组合产生SIMR克隆的效率较低，只能用MitoPunch这种高通量平台来检测。对比143BTK-ρ0+HEK293T SIMR细胞产生约75个克隆，MitoPunch转移到原代成纤维细胞产生的SIMR克隆较少，可能与Hayflick极限或对MitoPunch程序的次优反应有关。如ADF ρ0受体生长最慢，在mtDNA耗尽后不久达到衰老（数据未显示），导致最少的SIMR克隆。平均而言，与BJ ρ0+PBMC1克隆相比，获得的BJ ρ0+HEK293T克隆为2倍左右，这可能与mtDNA-nDNA的相容性和代谢情况有关。SIMR成纤维细胞的重编程效率较天然成纤维对照组也降低了10倍。在非天然mtDNA小鼠胚胎成纤维细胞重编程中观察到了类似的减少，可能是由于mtDNA-nDNA相容性较低。

通过转录组数据观察到SIMR成纤维细胞中mtDNA-nDNA同化作用不完全，显示SIMR成纤维细胞和未被操纵的成纤维细胞之间有数百个DEGs。此外，尽管SIMR细胞在限制性培养基中培养需要ETC活性才能生长和存活，但SIMR和ρ0成纤维细胞的MitoCarta2.0和mtDNA编码的转录物最相似。这些数据表明，SIMR成纤维细胞中的外源性mtDNA不能完全沟通和影响nDNA，尽管能够支持选择性水平的ETC活性和细胞增殖代谢物的充分合成。支持这一观点的证据包括ddC暴露产生的nDNA损伤最小，SIMR成纤维细胞的代谢组和转录组谱在SIMR-iPSCs中大多被重置为未处理的BJ-iPSC谱。本文结果与一份报告一致，有报告称ρ0细胞的新陈代谢和表观基因组已经发生改变，形成胞质杂合体只能部分重置，本文结果与此一致。本文为研究稳定mtDNA移植及细胞命运改变后ρ0细胞转录和代谢的重置提供了一个平台。通过其他形式的线粒体转移接收外源mtDNA的细胞中，mtDNA转录谱是否也被扰乱需要进一步研究验证。

总之，本研究提供了一个原理性的线粒体转移途径，能够产生具有特定mtDNA-nDNA组合的不同命运的细胞，包括具有自然界中没有的基因组配对的克隆系。未来的研究将产生代表高能量需求组织的SIMR衍生细胞，如心肌细胞或神经元，以及目前无法产生的含有突变mtDNA的SIMR-iPSCs，以使mtDNA病患者特异性疾病和具有等基因核的药物筛选模型成为可能。此外本研究结果表明，线粒体转移实验的解释必须考虑到最初产生的细胞可能不显示完全的mtDNA-nDNA整合及随后的细胞途径恢复。这对于缺乏后续重编程潜力的细胞，如瞬时或转化的线粒体转移细胞系来说尤其显著，因为研究结果表明重编程和分化是重置nDNA表达谱所必需的。最后，本文的线粒体转移途径绕过了细胞中mtDNA和nDNAs的进化成对选择，扩展了人类群体中存在的基因组组合库，并产生了具有确定的mtDNA-nDNA组合和独特功能特性的不同命运的细胞库，用于研究和潜在的治疗应用。

参考文献：

Patananan, A. N. , et al. "Pressure-Driven Mitochondrial Transfer Pipeline Generates Mammalian Cells of Desired Genetic Combinations and Fates." Cell Reports 33.13(2020):108562.