靶向肺炎克雷伯菌的噬菌体疗法或可缓解IBD相关炎症

撰文｜617

炎症性肠病（IBD）是一种自身免疫性疾病，主要包括克罗恩病（CD）和溃疡性肠炎（UC）。越来越多的研究表明，肠道菌群与IBD紧密相关。与健康人相比，IBD患者的肠道菌群发生明显变化，多样性显著降低。此外，还有研究表明，侵袭性大肠杆菌、产肠毒素脆弱拟杆菌、多重耐药性肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae，Kp) 可能与IBD有关。

然而，当前多种针对肠道菌群的疗法效果不尽人意：广谱抗生素具有诸多副作用，包括可能会引发菌群失调、促进耐药性菌株生长等；菌群移植（FMT）的效果不一，甚至有研究表明FMT可能会导致某些患者的病情恶化。

噬菌体是一类可以针对性杀死宿主细菌的病毒。近年来，有多个使用噬菌体疗法成功治疗细菌感染的同情用药案例被报道，展现出了噬菌体疗法的潜力。然而，目前我们尚不清楚噬菌体疗法在治疗IBD上的潜力如何。

2022年8月4日，以色列魏茨曼科学研究所Eran Elinav教授的团队在Cell杂志上发表了题为Targeted suppression of human IBD-associated gut microbiota commensals by phage consortia for treatment of intestinal inflammation的文章。该研究不仅揭示了Kp与IBD的严重程度和恶化程度紧密关联，而且还证明了针对Kp的口服噬菌体疗法具有缓解IBD的潜力。

首先研究人员对4个分别来自法国、美国、以色列和德国的IBD队列数据（n=537）进行了分析，发现如之前的研究所示，CD和UC患者的肠道菌群多样性更低，且与健康人的肠道菌群显著不同。此外，处于爆发期和缓解期的患者的肠道菌群也存在差异。

进一步的分析发现，有5个菌种在所有队列的IBD患者和健康人之间存在显著差异。其中，仅有Kp在CD患者爆发期显著增加，且在UC患者的爆发期未发生耗竭。作者进一步对另一个来自美国的IBD队列进行分析，发现了类似的结果，即Kp显著富集于IBD患者，并且发现不同的饮食模式并不会对IBD和Kp之间的关联产生影响。因此，后续的研究主要聚焦于Kp。

由于许多病原体都具有耐药特征，于是作者探究了IBD患者肠道菌群的耐药情况。结果表明，与健康人相比，CD和UC患者耐药组的alpha多样性显著升高，且耐药组组成也发生明显变化，而且这一变化与Kp的丰度高度相关。

此外，作者还研究了可移动遗传元件（MGE）的变化情况。类似地，与健康人相比，IBD患者的MGE发生显著变化，并且这种变化与Kp所在的肠杆菌科显著相关。

在功能层面，IBD患者肠道菌群的聚类结果也与健康人显著不同，并且这种聚类分布与Kp的丰度不同相关。并且，CD和UC患者与健康人相比，在多条通路上都存在显著差异，包括与病原体存活相关的一氧化氮还原酶合成路径等。

上述一系列结果表明，Kp或与IBD的病情紧密相关。

接下来，作者进一步鉴定了与IBD相关的具体Kp菌株，发现Kp KSB1_4E菌株显著富集于所有的IBD亚型，并且在疾病爆发期的丰度显著高于缓解期。有意思的是，这一菌株与此前鉴定的Kp-2H7菌株（可诱导TH1细胞介导的炎症免疫应答，加重结肠炎）属于同一个进化分枝——Kp2类，这一分枝与功能性多位点序列分型（MLST）谱图ST323相关。

为进一步确认Kp2与IBD之间的因果关系，作者从以色列队列的IBD患者中分离出了598个Kp菌株。这些菌株根据MLST被分为Kp2类和非Kp2类，并从中挑选了10株Kp2类和9株非Kp2类菌株进行后续实验。

接着，作者给无菌WT小鼠口服了来自于IBD患者的Kp2类菌株，并检测了Kp2类菌株的定植和促炎症情况。结果表明，Kp2类菌株可以有效定植并在结肠中引发免疫反应（主要为Th1反应）。并且与非KP2类的菌株KTCT 2242相比，来自于IBD患者的Kp2类菌株显著增加了干扰素-γ和IL-17的表达。

为进一步确认Kp2类的促炎症作用，作者给无菌Vert-X IL-10-eGFP-reprter小鼠定植了12株分离自IBD患者的Kp2类菌株。结果表明，Kp2类菌株对IL-10的刺激作用弱于非Kp2类菌株。

随后，作者给IL-10-/-无菌小鼠定植了具有高促炎潜力的Kp2类菌株，发现与未定植Kp2类菌株的小鼠相比，定植Kp2类菌株小鼠的干扰素-γ表达增高，并且肠道固有层干扰素-γ的表达情况与肠道炎症和受损情况高度相关。

综上，Kp2类菌株的促炎作用主要体现在干扰素-γ的高表达和IL-10的低表达两个方面。

基于上述证据，作者决定尝试采用噬菌体疗法来抑制与IBD发展紧密相关的Kp2类菌株，从而实现缓解IBD的目的。

首先，作者分离了一系列针对Kp2类的噬菌体，并不断迭代优化，经过体外和体内测试后，最终筛选出对Kp2类细菌最具杀伤力的噬菌体鸡尾酒——噬菌体鸡尾酒5（E）。5（E）包括MCoc5c、8M-7、1.2-3s、 KP2-5-1和 PKP-55五种噬菌体。

接着作者在经抗生素处理、定植Kp-2H7的小鼠上测试了口服不同剂量和频率噬菌体鸡尾酒5（E）的效果差异。结果表明，每周口服3次109 PFU/ml浓度的噬菌体鸡尾酒的效果最佳。

在确定剂量方案后，作者在定植了Kp-2H7并经DSS诱导的结肠炎小鼠模型中进行了测试。结果表明，噬菌体疗法能够显著减少小鼠粪便和肠道黏膜中的Kp-2H7，并缓解炎症情况。并且，长时间使用该疗法并未引发噬菌体抗性。

然后，作者在人造人类肠道系统SHIME中进行了测试。具体地，作者选取了噬菌体鸡尾酒5（E）中的两种噬菌体1.2-3s和MCoc5c进行了测试，发现虽然胃部较低的pH环境会对噬菌体的活性造成较大损害，而相对较高的胃部pH环境对噬菌体的杀伤力较低。并且肠道环境对噬菌体活性的影响较小。

最后，作者在人体中对噬菌体进行了测试——开展了一项随机、单盲、安慰剂对照1期临床试验。该试验招募了18名健康人，志愿者被随机分配至噬菌体组（每剂共含2.8x1010 PFU的1.2-3s和MCoc5c）和安慰剂组。此外，为提高噬菌体的存活率，志愿者还会服用埃索美拉唑，以提高胃部pH。

试验结果表明，含有1.2-3s和MCoc5c的噬菌体疗法耐受性和安全性良好，不良事件发生率与安慰剂组无明显差异，最常见的不良反应包括头痛、恶心和腹胀等。在使用噬菌体疗法后的几天内，在所有受试者中均检测到噬菌体。并且对受试者的粪便菌群检测发现，Kp的丰度下降，且未发生脱靶失调现象。

综上，该研究揭示了Kp在IBD疾病中的促炎作用，并且初步证明了口服噬菌体疗法的可行性，为IBD的治疗提供了新思路和新依据。

https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(22)00850-9

制版人：十一

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