四川大学华西医院吴昊星研究员课题组Org. Lett.：反式环辛烯激活的四嗪醚、酯生物正交断键反应

生物正交断键反应是一类通过串联的反应历程实现特定化学键断裂的生物正交反应。利用这类反应可以在活细胞乃至活体中实现生物分子的激活或药物靶向释放，为生物医学领域研究相关生命过程机制、实现精准诊疗提供有力工具。四嗪生物正交反应因其良好的生物相容性、快速的反应动力学等特点成为生物正交领域的研究热点。前期多个课题组报道了烯丙位氨基甲酸酯取代的反式环辛烯（TCO）衍生物可作为断键前体，与四嗪发生“点击-释放”反应后，实现对胺、羧酸、酚类化合物的释放。但由于烯丙位取代的TCO与四嗪之间相对较慢的二级反应动力学制约了该策略在活体中的某些需要低浓度的生物医学应用。

最近，亚甲基四嗪与胺类化合物可通过氨基甲酸酯构建一种新型的生物正交断键前体，从而实现从四嗪分子端释放胺类化合物。由于这类反应不需要以动力学较慢的烯丙位取代TCO为反应前体，从而有望使用其他具有超快动力学的TCO以降低生物正交应用的实施浓度、推动新的前药设计和药物释放策略。但是，现有策略仅限于仲胺类化合物，其他药物分子中常见官能团（例如酚基和羧基）的四嗪断键前体如何设计仍亟待解决。近日，四川大学华西医院吴昊星研究员课题组报道了以四嗪分子为前体的酚、羧酸类化合物生物正交断键反应设计策略，并系统性的探索四嗪结构与断键反应间的构效关系（Org. Lett.2022, 24, 29, 5293–5297）。

图1. 反式环辛烯（TCO）激活的四嗪醚、酯的生物正交断键反应（来源：Organic Letters）

作者首先利用7-羟基香豆素和亚甲基四嗪通过醚键构建反应前体，并与TCO反应，通过液质联用（LC-MS）观察到快速且近乎定量的香豆素释放，证明了TCO激活的四嗪端酚基释放的可行性（图2）。有趣的是，其他亲二烯体如BCN、Sph、Mcp均未观察到明显的释放反应。同时，作者发现4e-TCO比4a-TCO释放率更高，推测可能是由于反应生成的2,5-和1,4-二氢哒嗪的比例不同，但具体机制有待进一步研究。作者进一步探索了四嗪上取代基的结构与断键反应间效率之间关系，结果表明，四嗪6位的烷基取代基和亚甲基桥上的甲基取代均促进断键反应的进行。综合动力学和稳定性研究，作者认为甲基取代的四嗪1a显示出生物正交动力学、释放速率和稳定性的最佳平衡，最有望用于体内应用。1d超快的释放速率使其对较短时间的活细胞成像或体外检测等应用具有吸引力。

图2. 四嗪醚的释放特性和稳定性（来源：Organic Letters）

作者进一步探究了TCO激活的四嗪酯的生物正交断键反应，并以萘酰亚胺和苯基吗啉为例分别研究了脂肪酸和苯甲酸的释放情况（图3）。对脂肪酸而言，大部分底物在缓冲液中表现出快速释放、高释放率以及良好的稳定性。考虑到与TCO的反应活性，作者认为2a和2f类似物将更适合用于复杂的生物环境。对苯甲酸而言，所有底物均具有良好的稳定性，且3位烷基取代的四嗪比苯基四嗪具有更高的释放率。同样地，亚甲基桥上的甲基取代显著加快了释放过程，但对释放率、稳定性和二级速率常数影响较小。由于生物正交断键反应广泛用于可控性前药激活，作者进一步研究了该策略在活性药物甲芬那酸和替米沙坦中的应用。通过酯键构建生理条件下稳定的四嗪前药，经TCO反应激活，两种前药均实现快速高效的药物释放。

图3. 四嗪酯的释放特性和稳定性（来源：Organic Letters）

为了验证这种新型断键策略在生理条件下的可行性和特异性，作者用1a进行了活细胞成像（图4）。与对照组相比, 在实验组的HeLa细胞中检测到明显的荧光信号, 表明香豆素的释放。

图4. TCO激活的四嗪香豆素释放反应用于活细胞成像（来源：Organic Letters）

总结：

作者开发了一种基于亚甲基四嗪醚或酯的新型生物正交断键策略，作为断键前体的四嗪衍生物通过与高活性的TCO反应从而实现苯酚、羧酸化合物的可控释放。实验结果表明甲基四嗪醚或酯具有良好的稳定性、释放性能和生物正交反应动力学。在亚甲基桥上引入甲基取代可以加速释放反应，但会相应降低四嗪化合物的稳定性。作者证明了这种生物正交断键在活细胞等生命环境中也可顺利进行，表明其在新型抗体-药物偶联物、药物递送系统和生物材料的设计等方面具有很大潜力。

该工作以“Bioorthogonal cleavage of tetrazine-caged ethers and esters triggered by trans-cyclooctene”为题发表在Organic Letters（DOI: 10.1021/acs.orglett.2c01873）上，第一作者为四川大学王雅乐博士，华西医院沈国华博士，通讯作者为四川大学华西医院吴昊星研究员和冯萍教授，相关工作受到国家自然科学基金项目的资助。

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