Nature子刊：斯坦福大学团队工程化改造环状RNA，蛋白质表达量可提高数百倍

去年 2 月，全球首家“环状 RNA”新锐 以 8000 万美元的融资走出隐匿模式，这家公司的成功“出圈”一举带火了环状 RNA，让其成为 RNA 领域最新的研究热点。

环状 RNA（circRNA）是一类特殊的非编码 RNA 分子，呈封闭环状结构，不受 RNA 外切酶影响，因而 可以更加高效和稳定地表达蛋白质 。除了天然的 circRNA，合成的 circRNA 和一些内源性 circRNA 也可以编码蛋白质，这大大提高了 circRNA 作为基因表达平台的前景。

近日，斯坦福大学医学院 课题组 开发了一种全新的系统方法，用来快速组装和测试影响合成 circRNA 蛋白质生产的特征，并通过优化设计把 circRNA 蛋白质产量提高了数百倍。 目前，这项研究已经以“”（工程化环状 RNA 以提高蛋白质产量）为题发表在 Nature Biotechnology 上。

（来源：Nature Biotechnology）

试验之初，为了实现 circRNA 的更高通量测试， 团队构建了一个模块化的克隆平台。借助该平台，他们可以较为精确地分析对 circRNA 优化和设计的各个方面究竟如何影响其翻译。

▲图｜用于 circRNA 的模块化克隆平台可实现快速的设计-构建-测试周期（来源：Nature Biotechnology）

在这项研究中， 团队对 circRNA 进行了优化，包括上游 IRES 拓扑、5' PABP 间隔区、HBA1 3' UTR 和 HRV-B3 IRES 与近端环 Apt-eIF4G 插入结合在一起，以测试 circRNA 在体内的表达。

通过腹腔注射给小鼠注射编码 NanoLuc（萤光素酶）的 circRNA，与未经治疗的小鼠相比，接受 circRNA 的小鼠在 1 小时内表现出更高的发光活性，表明 工程化的 circRNA 可以在体内表达。

▲图｜工程化 circRNA 在体内表现出更持久的翻译和功能活性（来源：Nature Biotechnology）

随后， 团队使用编码人类促红细胞生成素（hEPO，一种用于治疗贫血的分泌蛋白）的 RNA 在经过环化改造后，与未经修饰的 mRNA 在体内的进行比较。

通过 CAR-T 对小鼠进行静脉内给药后，改造后的 circRNA 的血浆 hEPO 水平最初低于未经修饰的 mRNA 的水平，48小时以后（见上图），改造后的 circRNA 的血浆 hEPO 水平远高于未经修饰的 mRNA 的水平。这表明， 工程化的 circRNA 可以在体内以与修饰的 mRNA 相似的强度表达，而且持续时间更长。

“为了让 circRNA 的翻译实现最大化，我们优化了五个要素，包括载体拓扑结构、5' 和 3' 非翻译区、内部核糖体进入位点以及合成适体启动翻译机制。”斯坦福大学医学院皮肤病学和遗传学教授、霍华德·休斯医学研究所研究员 教授表示， “通过这些优化设计，我们把 circRNA 蛋白质产量提高了数百倍，在体外可以提供比 mRNA 更多的翻译，在体内可以提供更持久的翻译。”

▲图｜斯坦福大学医学院 Howard Chang 教授（来源：Howard Hughes Medical Institute）

在哈佛医学院获得医学博士学位后， 进入斯坦福大学医学院皮肤科进行临床实习。2018 年，他加入霍华德·休斯医学研究所担任研究员，研究方向主要围绕人类疾病的 RNA 表观基因组学。Howard Chang 课题组开发了预测、解剖和控制大规模基因调控程序的方法，这些方法为人类发展、癌症和老龄化提供了新的见解。目前，Howard Chang 课题组正在探索 circRNA 在疾病中发挥的作用，他和团队发现在基因控制方面，circRNA 具有不同的作用模式，是一些人类疾病（比如癌症）的关键因素。

早在 1976 年，人类便在电子显微镜下首次观察到了真核细胞中存在的 circRNA 分子，但受限于当时的技术水平，科学家们无法对其进行充分而详实的研究。

直到 2012 年，斯坦福大学和霍华德·休斯医学研究所的科学家们证实在人体细胞的基因表达程序中，相较于线性 RNA 分子，circRNA 分子是一个更普遍的特征，它们 稳定且普遍地存在于真核细胞中。

随后，两项发表在 Nature 上的研究揭示出很多 circRNA 充当分子“海绵”：circRNA 分子富含 microRNA 结合位点，其通过与疾病关联的 microRNA 相互作用进而在疾病中发挥重要的调控作用。此外，研究人员推测 circRNA 还具有许多其他的功能，这些 circRNA 分子构成了一个“隐秘而未知的 RNA 平行宇宙”。

在经典的基因表达模型中，每个 RNA 分子由线性的化学“碱基”串联组成，由于反向剪接而产生的非编码 RNA（circRNA）与传统的线性 RNA 不同，circRNA 分子呈封闭环状结构，不易被降解，能够大幅提高 RNA 的表达时长和表达产量。

就现阶段而言，circRNA 才刚刚起步，虽然它的优势明显，产业化前景广阔，但现阶段还存在一些局限性，比如环化效率低，并且难以精准快速地制备，这都是其产业化过程中所面临的挑战。因此，上游的技术储备显得非常重要。这项最新的研究，通过一系列工程化技术手段将 circRNA 蛋白质产量提高了数百倍，为今后的产业化应用提供了一种新的途径。

参考资料：

1.

2.https://www.hhmi.org/scientists/howard-chang

3.https://www.hhmi.org/2018-investigators/howard-chang

4.https://baike.baidu.com/item/%E7%8E%AF%E7%8A%B6RNA/2192592?fromtitle=circRNA&fromid=19660786&fr=aladdin